Journal 
서 론
한국에서 해초강 멍게과 (Pyuridae)에는 5속 (Boltenia, Halocynthia, Herdmania, Microcomus, Pyura) 16종이 보 고 되어있다 (KSSZ 1997). 이 가운데 멍게 (Halocynthia roretzi)는 수온이 낮고 조류 소통이 원활한 바위 등의 단단한 기질에 부착하여 서식하는 해양고착성으로 체 표면이 피낭으로 감싸여져 있어 피낭류라고도 한다.
한국에서 멍게의 양식생산량은 2002년 10,579톤, 2010 년 6,364톤, 2013년 10,282톤으로 불규칙한 변동 경향을 나타내고 있는데, 이러한 주요 요인은 물렁증 (soft tunic syndrome)에 의한 대량폐사에 기인하는 것으로 보고되 고 있다. 멍게의 물렁증은 피낭이 얇아지며, 팽압이 저하 되면서 탄력성이 감소되어 상품가치의 저하는 물론, 대 량폐사의 원인으로 보고되었다(NFRDI 2009).
멍게 물렁증의 발생에 관한 연구는 수온과 수용밀도 (Shin et al. 2011b), 바이러스(Song et al. 2009), 원인체 미 생물 (Kim et al. 2010) 및 체내 기생충(Kumagai et al. 2010, 2011; Shin et al. 2011a; Kim et al. 2014) 등이 보고 되고 있다.
일반적으로 수서동물의 생리기능에 영향을 미치는 외 부환경요인은 수온, 염분농도, 용존산소, 먹이 및 병원생 물 등을 들 수 있으며, 이 가운데 온도는 대사율, 활성도 및 에너지 균형 등에 영향을 미치는 직접적인 요인이다 (Newell and Kofoed 1977; Bayne and Newell 1983).
남해안에 소재하고 있는 멍게 양식장은 주로 통영, 거 제 연안에 위치하고 있으므로 수온, 염분농도 및 용존산 소 등 환경 변화에 대한 영향을 받는다. 물렁증 발생은 산란 후 멍게가 주로 성장하는 시기인 2~5월에 주로 발생하며(NFRDI 2009), 물렁증이 발생하면 대부분 치료 가 어려운 것으로 알려져 있다.
본 연구에서는 물렁증 치료가능성 및 이에 대한 대책 을 위한 기초자료를 얻기 위해서 물렁증 진행단계에 따 른 대사변화, 면역학적 및 조직병리학적 반응 등을 조사 하였다.
재료 및 방법
1.재료
실험에 사용된 멍게는 2012년 9월 남해안의 한산∙거 제만에 위치한 멍게 양식장에서 채집하였다. 채집한 멍 게는 수온 18±1°C, 염분농도 32±0.5 psu 조건에서 7일 간 순치시킨 후 실험에 사용하였다. 실험에는 개체의 피 낭 탄성, 체색, 피낭 돌기의 형태 등의 기준 (Kitamura et al. 2010; Shin et al. 2011a)에 의해 물렁증 증상이 없는 개체들을 사용하였다. 실험에 사용한 개체는 인공종묘생 산 후 20~24개월 된 것으로 체고 70.7~86.3 mm, 전중 61.9~93.8 g이었다.
2.방법
1)물렁증 유도 및 사육조건
물렁증은 수온을 조절하여 유도하였다. 실험수온은 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27±1°C이었으며, 염분농도는 32± 0.5 psu를 유지하였다. 수온은 냉각기와 히터를 이용하여 조절하였다. 사육수는 병원균을 제거하기 위해 UV 조사 후, ø 10 μm 이하로 여과한 해수를 사용하였다. 먹이는 Isocrysis galbana와 Chaetoceros sp.를 1 : 1로 혼합하여 매일 2회 공급하였다. 실험기간은 35일이었으며, 실험수 조는 100 L 용량으로 실험개체는 각 실험수조 당 120마 리씩 수용하였다.
2)물렁증 단계 구분 및 유도율
멍게의 물렁증 진행단계는 개체의 피낭 탄성, 체색, 피 낭 돌기의 형태 등의 특징을 고려하여 4단계(S0, S1, S2, S3)로 구분하였으며, 물렁증 발생 여부는 실험수온별 24 시간 간격으로 확인하였다. S0는 정상개체로서 수관의 수축반응이 1~2초 내에 이루어지고 돌기가 수직으로 형성되어 있는 상태를 기준으로 하였다. S1은 수관의 형 태가 뚜렷하지 못하고 부어오른 형태를 보이며, S2는 피 낭이 얇아지고 늘어나기 시작하고 섭이능력이 감소하며 S3에는 아치사 또는 사망단계로서 수관의 수축력이 없 어지는 상태를 기준으로 하였다.
3)산소소비율과 여수율
실험생물의 산소소비율은 용량 1.5 L의 호흡측정 챔버 를 사용하였으며, 호흡측정기 내 용존산소의 농도는 용 존산소측정기 (Orbis, 3600 made by Switzerland)를 이용 하여 실험 전후 용존산소의 차로서 구하였다. 여수율은 수온 15±1°C, 염분농도 32±1 psu에서 Cole and Hepper (1954)의 방법에 의하여 1 L 용량의 수조에 0.001%의 neutral red 해수를 넣은 다음 실험동물을 넣고 실험 전 후의 색소과립 제거율을 spectrophotometer의 파장 500 nm에서 측정하여 계산하였다.
FR=(Log Co-Log Ct)*M/Loge*t
FR: filtration rate
Co: 0.001% neutral red concentration
Ct: neutral red concentration after t time
M: volume
t: time
4)혈구 구성비
혈구는 2 mL 1회용 주사기로 체강액을 추출하여 0.1M phosphate buffer (pH 7.5)로 완충시킨 2.5% glutaraldehyde 용액으로 1시간 동안 전고정하였다. 그 후, 1000 rpm으로 5분간 원심분리 하여 혈구 pellet을 제작하여 전고정액으 로 12시간 동안 재고정하였다. 그리고 1% osmium tetroxide (OsO4) (Sigma)로 1~2시간 후고정한 다음 0.1 M phosphate buffer로 세척하고 ethanol로 단계별 탈수하였다. 이후 에폭시 수지로 포매하고, 1~0.5 μm 두께의 semithin section을 만든 다음 toluidine blue로 염색하여 관찰하였 다. 혈구의 종류는 Shin et al. (2012)의 보고에 따라 여섯 가지로 구분하였다. 혈구의 종류별 분포율은 image analyzer (IMT-VT Image analysis, IMT Inc., USA)를 이용하여 분석하였으며, 혈구의 구분과 명칭은 Milanesi and Burighel (1978), Burighel and Cloney (1997) 및 Shin et al. (2012) 의 방법을 따랐다. Image analyzer로부터 얻어진 자료는 Excel 2007 (Microsoft Corporation, USA)을 이용하여 통 계분석을 실시하였다.
5)조직학적 분석
피낭, 수관부, 새낭, 육질부 및 소화선을 적출하여 조직 학적 분석을 실시하였다. 시료는 aqueous Bouin’s fluid에 12시간 동안 고정한 후, 24시간 동안 수세하였다. 그 후 단계별 ethanol 탈수과정 후 paraplast (McCormick, USA) 에 포매하였다. 포매된 시료는 microtome (RM2235, Leica, Germany)을 이용하여 4~6 μm 두께로 연속 절편하여 조 직표본을 제작하였다. 표본은 Mayer’s hematoxylin-eosin (H-E) 염색과 alcian blue-periodic acid and Schiff’s solution (AB-PAS, pH 2.5) 반응을 실시한 후 광학현미경으로 관 찰하였다.
6)통계학적 분석
자료 분석에 사용한 통계처리는 SPSS-통계패키지를 이용하여 ANOVA test를 실시한 후 각 값에 대한 평균 값을 Duncan’s multiple range test를 통해 유의수준 95% 로 검정하였다.
결 과
1.수온에 따른 물렁증 유도율
수온조절에 의한 멍게의 물렁증 유도율은 Table 1에 나타내었다. 다양한 수온조건에 노출된 멍게에서 물렁증 은 노출 10일째 수온 15°C 조건에서 처음 나타나기 시작 하여 35일째 수온 9°C에서 82%, 수온 15°C에서 100% 의 물렁증 발생률을 나타냈다. 수온 18°C 이상에서 물렁 증 발생률은 3.5~8.7%로 수온 15°C 이하 조건에 비해 현저히 낮게 나타났다.
2.산소소비율과 여수율의 변화
물렁증 진행단계에 따른 멍게의 산소소비율은 정상개 체인 S0에서 0.82±0.14 mg O2/g DW/h로 물렁증이 진행 되고 있는 S1-S3에 비해 유의하게 높았다 (p⁄0.05). 그 러나 물렁증이 진행되는 S1-S3에서 산소소비율은 0.57 ~0.48 mg O2/g DW/h로 S1에서 다소 높았으나 유의한 차이는 나타나지 않았다(p¤0.05) (Fig. 1).
멍게의 여수율은 산소소비율과 유사한 경향을 보였다. 정상개체인 S0에서 여수율은 0.68±0.18 L/g DW/h, S1에 서는 0.45±0.13 L/g DW/h로 물렁증 S0에 비해 여수율 은 34% 감소하였다. 아치사단계인 S3에서 여수율은 0.26 ±0.07 L/g DW/h로 S0에 비해 62% 감소하여 물렁증 단 계가 진행될수록 여수율은 현저히 감소하였다(Fig. 2).
3.혈구 구성비의 변화
물렁증 진행단계에 따른 여섯 종류 혈구 (hyalinocyte, granulocyte, phagocyte, nephrocyte, morula cell, multi-vacuole cell)의 조성비 변화는 Fig. 3과 같다.
S0에서 혈구의 종류별 구성비는 multi-vacuole cell이 69.4%로 가장 높았으며, morula cell이 3.3%로 가장 낮았 다. 멍게의 물렁증 진행단계에 따른 혈구의 조성비 변화 는 혈구종류별로 다소 차이는 있었으나 특히, multi-vacuole cell과 morula cell에서 뚜렷한 변화를 보였다. Multivacuole cell은 S0, S1, S2, S3에서 각각 69.4, 33.2, 37.4, 32.1%로 약 1/2의 감소를 나타냈다. 반면, morula cell은 S0, S1, S2, S3에서 각각 3.3, 33.2, 33.0, 35.4%로 약 10배 의 증가를 보였다.
4.기관계의 조직학적 변화
1)피낭
멍게의 피낭은 기저막으로 부터 상피층, 기질 및 큐티 클로 구성되어 있었다. 상피층은 단층으로 섬모원주형 상피세포들과 점액세포들로 구성되어 있었다. 기질은 결 합조직층으로 미세섬유들이 규칙적인 동심원상으로 치 밀하게 배열된 구조이며, 큐티클은 가장 바깥쪽의 치밀 한 막 구조였다. S0에서 피낭의 뚜렷한 구조적 이상은 확인되지 않았다 (Fig. 4A). S1에서는 기질부의 미세섬유 들 간격이 불규칙하고 느슨해진 것이 확인되었다 (Fig. 4). S2와 3에서는 상피층의 위축과 일부 상피세포들의 탈락이 관찰 되었다 (Fig. 4C, D). 그리고 상피층 근처의 기질부 미세섬유들은 간격이 더욱 느슨해지고 분절화 되는데, 이러한 변성은 기저막에서 부터 큐티클 쪽으로 진행되는 양상이었다(Fig. 4C, D).
2)수관
수관 횡단면의 조직학적 구조는 가운데 근육층을 중 심으로 양쪽으로 결합조직층, 상피층, 기질 및 큐티클로 구성되는데, 상피층, 기질 및 큐티클의 구조는 피낭과 동 일하였다. S0에서는 가운데 결합조직층의 일부 조직학적 변성을 제외하고는 뚜렷한 구조적 이상은 나타나지 않 았다 (Fig. 5A). S1에서 상피층은 결합조직과 함께 근육 층으로부터 분리되고, 기질부의 미세섬유들의 간격이 넓 어지는 변성이 나타났다 (Fig. 5B). S2에서는 근섬유의 갈라짐과 분절화가 뚜렷하였으며 (Fig. 5C), S3에서는 상 피층과 인접한 기질부 미세섬유층의 공포화와 괴사 및 근섬유 다발의 붕괴가 확인되었다(Fig. 5D).
3)새낭
아가미는 피낭 내부 체벽 근육층의 안쪽에 주머니 형 태인 새낭으로 위치하며, 새낭 측벽에는 새공 구조들이 종과 횡으로 배열된 격자모양이었다. 새공 상피세포들은 입방형 또는 섬모원주형 세포였다. S0에서 아가미 새공 의 구조적 이상은 확인되지 않았다 (Fig. 6A). S1에서는 새공 상피세포들의 비대와 새공의 직경 감소가 나타났 으며 (Fig. 6B), S2에서는 혈구의 증가, 새공 상피세포들 의 공포변성 및 측면 섬모의 소실(Fig. 6C), S3에서는 새 공 상피세포들의 변성 및 붕괴로 대부분의 새공이 폐쇄 된 조직상을 보였다(Fig. 6D).
4)육질부
육질부는 상피층, 결합조직층 및 근육층으로 구성되는 데, 근육층은 근섬유 다발들이 발달된 종주근과 환상근 층으로 구분할 수 있었다. S0에서는 일부 근섬유 다발의 구성이 느슨해진 것이 관찰되었으며 (Fig. 7A), S1에서는 근섬유 다발이 전체적으로 느슨해지며, 일부 근섬유 다 발에서 공포화가 나타났다 (Fig. 7B). S2와 3에서는 종주 근층과 환상근층 사이의 결합조직층의 분리, 근섬유의 갈라짐 및 분절화 그리고 근섬유들의 붕괴가 확인되었 다(Fig. 7C, 7D).
5)소화선
소화선은 다세포선으로 다수의 관포상선 (tubuloacinar gland)들로 구성되는데, 상피층은 단층이며, 상피세포들 의 형태는 섬모원주형이었다. 상피세포의 길이는 기저 쪽의 세관부에 비해 맹낭부에서 더 길다. 맹낭부의 상피 세포 세포질에는 H-E 염색과 AB-PAS (pH 2.5)에 음성으 로 반응하는 미세공포들이 분포한다. S0에서 소화선의 구조적 이상은 확인되지 않았다 (Fig. 8A). S1에서는 소 화선 세관 기저부 상피층 기저막의 박리와 맹낭부 상피 층의 위축이 나타나며 (Fig. 8B), S2에서는 맹낭부 상피 층 기저막의 박리와 맹낭부 상피층이 일부 붕괴된 조직 상이 확인되었다 (Fig. 8C). S3에서는 소화선 세관 기저 부 및 맹낭부 상피층의 붕괴가 확인되었다(Fig. 8D).
고 찰
일반적으로 수서생물의 대사활동은 수온에 의해 조절 되며 생물의 모든 생화학적 생리적 활성에 영향을 미친 다. 수온의 증가는 대사율을 증가시키고 대사율의 증가 에 따라 산소의 요구가 많아지므로 수온의 증가에 의해 서 체내 생리적 리듬을 교란시키는 박테리아 등의 병원 균을 증식시킬 수 있는 원인이 되므로 수서생물의 건강 에 영향을 미칠 수 있다 (Magnuson et al. 1979). 멍게의 적정 성장수온은 12~20°C으로 25°C 이상에서는 대사 장애가 나타나며, 26.5°C에서는 수관을 닫고 호흡활동을 정지하며 이러한 조건이 일정기간 지속될 경우 사망한 다(Zhang and Lim 1990).
물렁증 발생은 멍게 주성장시기인 11월부터 이듬해 6 월까지 수온이 18°C 이하인 겨울철에 주로 발생하며, 먹 이 발생량이 높은 내만에 소재한 양식장에서 많이 발생 한다(NFRDI 2009). 본 연구 결과, 물렁증 발생률은 수온 6°C~35일 조건에서 20%, 9°C~35일 조건에서 82%로 9°C 이상에서 급격히 발생하여 주성장수온인 15°C에서 35일 만에 100%를 보였다. 그러나 18°C 이상에서 물렁 증 발생률은 4.3~8.7%으로 매우 낮아 멍게에서 발생하 는 물렁증은 수온과 상관성이 있는 것으로 나타났다. 멍 게의 물렁증 진행은 수온 9°C의 경우 S0에서 S1로 진 행되는 데 소요되는 시간은 22±1일, S1에서 S2는 3±1 일, S2에서 S3로 진행되는 데 소요되는 시간은 2±1일 로 초기 물렁증 잠복기간은 약 20일 전후로 추정되며, 물렁증이 한번 발생하게 되면 S2 이후 빠르게 진행되므 로, 이는 멍게양식장에서 수온 10~18°C 시기에 대량폐 사로 이어지는 주요 요인이 되는 것으로 보인다.
멍게류와 같은 고착생물의 경우 활동량이 적으므로 호 흡량이 적고 혈액 내 분화된 호흡수송체의 조절 없이 호 흡할 수 있도록 적응되어 있다. 또한 먹이섭취는 비선택 적으로 부유물을 여과섭취하며, 먹이의 농도에 따라 섭 취율이 다르다 (Jørgensen 1949, 1955; Stuart and Klumpp 1984). Ascidia nigra의 산소소비율은 28°C에서 806 μL O2/h/gDW (Goodbody 1974)이며, Crassostrea virginica는 수온 24°C에서 645~1504 μL O2/h/gDW(Goodbody 1974) 이다. 본 연구에서 멍게의 산소소비율은 수온 12°C에서 0.82 mg O2/h/gDW으로 각 종간에 산소소비율의 차이는 있으나, 이는 서로 다른 수온에 순치된 결과로 여겨지며, 고착생물이라 하더라도 종간 차이가 있는 것으로 여겨 진다.
멍게 피낭의 물렁증 특징은 초기단계인 S1에서 수축 반응이 대조구에 비해 느려지며, 피낭지수, 피낭색 및 형 태 등 다양한 변화를 보이며 호흡률, 배설률 및 여수율 등의 대사반응에도 장애가 나타났다.
여수율은 정상단계인 S0에 비해 S2이후에 60% 감소 하였는데 이는 수관을 통한 먹이공급 및 호흡에도 영향 을 미칠 것으로 추정되며, 체내 대사의 장애로 인해 수 관의 기능이 저하됨으로써 입수관으로 들어온 외액이 출수관을 통해 배출되지 못함으로서 체내 보유하는 체 액의 양이 증가하는 것으로 추정된다. 이는 피낭의 조직 학적 변화에서도 관찰이 가능하다.
Botrylloides leachi에서 vacuolated cell들은 주로 대사 물질의 저장 기능을 가지며(Cima et al. 2001), morula cell 은 전자밀도가 높은 물질들로 채워진 다수의 액포를 함 유하는데, 이들의 크기와 수는 동일종에서도 차이가 있 다(Hirose et al. 2003). Botryllus schlosseri에서 morula cell 의 액포는 phenoloxidase와 quinone을 함유한다 (Frizzo et al. 2000; Ballarin et al. 2001). Phenoloxidase와 quinone 은 항산화 및 전자전달계의 기능에 관여하는 물질이라는 점에서 물렁증 진행에 따라 대사물질의 축적은 감소하 고 반면, 에너지 소비는 증가하는 특징의 설명이 가능할 것이다.
피낭에서 확인된 조직학적 이상 가운데 상피층의 변성 은 기질합성 기능의 저하로 이어질 것으로 판단되며, 이 러한 현상은 멍게의 팽압을 감소시키는 중요한 요인으로 생각된다. 일반적으로 미세섬유의 기능은 세포 내 골격으 로 다양한 연체동물의 세포질에서 당김세사(tonofilament) 로서 세포의 형태유지에 중요한 기능을 한다 (Singley 1982; Lee et al. 2014). 또한 멍게류의 여수율 또는 먹이섭 취율은 먹이 농도, 입수관의 직경, 출수관의 배출빈도 등 을 일시적으로 변화시켜 조절한다(Armswrthy et al. 2001). 멍게의 수관부에서 피낭을 구성하는 미세섬유층과 근육 층의 변성은 멍게에서 물을 흡입하는 능력을 감소시킴 으로써 멍게의 팽압 감소와 호흡 및 먹이섭취능력을 저 하시키는 요인 가운데 하나로 판단된다. 새공 및 새공 상 피세포들의 구조적 이상의 결과는 개체의 호흡 및 여과 기능의 저하를 유발하는 변성으로 판단된다. 육질부 근 육층의 변성은 수관부의 조직학적 변성과 함께 물을 흡 입하는 능력을 감소시킴과 동시에 멍게의 팽압을 저하 시키는 요인으로 판단된다. 소화선은 삼투조절, 효소분비 와 pH 조절에 의한 화학적 소화 및 배설기능을 수행하 는 기관인데(Burighel and Cloney 1997), 소화선의 조직학 적 변성은 소화선의 비정상적인 대사를 유발하는 지표 가운데 하나로 판단된다.
위의 결과를 종합하여 보면 멍게의 물렁증은 수온 9 ~15°C에서 주로 발생하며 S1에서 약 20일의 잠복기간 이 지나면 비정상적인 대사장애가 유발되어 물렁증은 빠르게 진행되고 폐사에 이르는 것으로 추정된다.
적 요
수온조절 (6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27°C)에 의해 유도된 멍게의 물렁증 진행에 따른 생리학적 특성을 연구하였 다. 수온조절에 의한 물렁증 유도율은 수온 15°C에서 가 장 높았으며, 24°C에서 가장 낮았다. 물렁증은 피낭 색깔 및 탄성을 기준으로 S0, S1, S2, S3의 4단계로 구분하였 다. 정상개체와 물렁증을 가진 개체들 사이에서 산소소비 율과 여수율은 유의한 차이를 보였다. S0에 비해 S3단계 에서 혈구 구성비의 가장 뚜렷한 변화는 multi-vacuole cell은 약 1/2 감소하였으며, morula cell은 약 10배 증가 하였다. 기관계 구조의 변화는 피낭, 수관, 새낭, 육질부, 소화선에서 상피세포의 변성, 미세섬유의 변성, 혈구의 증가 및 근섬유의 변형이 확인 되었다. 이러한 모든 특 징들은 멍게의 정상적인 생리학적 기능에 영향을 미칠 수 있다.
