서 론

수계로 배출되는 다양한 유해물질에 대한 위험을 극복 하고자 미국을 비롯한 유럽의 여러 국가들은 1970년대 부터 지금까지 생물체를 이용해 검증하는 통합독성 관리 제도(Whole Effluent Assessment/Toxicity)를 개발하여 운 영하고 있으며, 우리나라도 2011년부터 생태독성 관리제 도를 도입하여 운영하고 있다(USEPA 2002; Korea Ministry of Environment 2011).

현재 국내 생태독성 관리제도하에 시행되는 생물시험 은 물벼룩 단일종을 이용한 급성독성시험으로 시험 생물 종인 Daphnia magna (D. magna)는 국내 수계에 전혀 서 식하지 않는 외래 생물 종이다. 단일 종을 이용한 생태 독성평가는 그 시험 종이 어떤 물질에 대해 민감도 특이 성을 나타내는 경우 그 물질에 대한 전반적인 독성을 이 해하는 데 어려움이 유발될 수 있다. 또한 국내 수계의 실정 및 먹이사슬을 통한 생물 종 간의 상호 관련성 등 을 고려한 수질환경 위해성을 평가하기 위해서는 국내 서식 종을 이용한 독성 평가기법의 적용이 바람직할 것 이다. 이와 같은 단점들을 극복하기 위하여 식물성 플랑 크톤(녹조류), 물벼룩류, 어류(알) 등 국내 생물 종을 이 용한 생태독성평가 기반연구가 수행되었고 최근 생태독 성 시험 생물 종의 다변화를 위한 연구도 진행되고 있 다(Nam et al. 2007; An et al. 2007, 2008).

식물성 플랑크톤은 1차 생산자로 수중의 넓은 생태적 적응 범위를 가지고 있기 때문에 수중의 물리화학적인 서식 환경의 변화에 따라 반응을 나타내어 하천이나 호 수 등의 수질상태를 파악하기 위해 자주 이용되는 대표 적인 지표 생물 종이다(Turbak et al. 1986). 그 중 유글레 나는 약산성 조건에서도 잘 성장하고 독성물질에 민감하 며(Ahmed and Häder 2010a, b; Jasso-Chávez et al. 2010; Azizullah et al. 2011) 체내에 엽록체를 가지고 광합성을 하는 식물적 특성과, 탄소원으로 유기물을 이용하고 세포 벽이 없으며 편모로 유영생활을 하는 원생동물의 편모충 류에 해당하는 동물적 특성을 동시에 가지고 있어(Carmer and Myers 1952; Brochiero et al. 1984; Einicker-Lamas et al. 2002) 다양한 유해화학물질 및 환경시료에 대한 식 물적 특성과 동물적 특성을 이용한 독성반응 측정 및 관 찰이 동시에 가능하다(Azizullahand Richter 2012). 이와 같은 장점들로 인하여 카드뮴, 수은 등 중금속을 비롯한 다양한 화학물질에 대해 유글레나를 이용한 독성평가가 수행되고 있으며 도출된 결과를 기반으로 수 생태 독성 평가에 적합한 생물 종이라고 제안되고 있다(Tahedl and Häder 1999, 2001; Einicker-Lamas et al. 2002). 그러나 다 양한 물질에 대한 유글레나의 독성반응 자료는 주로 Euglena gracilis (E. gracilis)를 이용한 시험으로부터 도출된 것으로 국내 서식 종인 Euglena agilis (E. agilis)에 대한 독성 자료는 거의 없으며 표준시험법도 설정되지 않은 실정이다.

따라서 본 연구에서는 E. agilis가 국내 수 생태계의 독 성 및 위해성을 평가하기 위한 시험 생물 종으로서의 적 용가능성을 평가하기 위하여 총 5종의 시험물질(acetone, chloroform, dimethyl sulfoxide (DMSO), ethanol, methanol) 에 대한 독성영향을 측정하여 현재 생태독성 시험 생물 종인 물벼룩(D. magna)과 생태독성평가 후보 생물 종인 국내 서식 물벼룩 (Moina macrocopa, M. macrocopa)과 해양 발광박테리아(Vibrio fischeri, V. fischeri)의 독성민 감도와 비교하였다.

재료 및 방법

1.시약 및 재료

Acetone, chloroform, dimethyl sulfoxide (DMSO), ethanol, methanol은 시그마알드리치사(Sigma-Aldrich, USA)로부 터 구입하여 사용하였다. 그 외 모든 시약은 고순도의 실험용 시약을 사용하였다. 시험물질의 이화학적 성상은 Table 1에 나타내었다.

2.E. agilis의 배양 및 시험 조건 수립

본 실험에 이용된 E. agilis는 인천대학교 수서독성 생 리생태학 실험실에서 분양받아 사용하였다. Sodium acetate가 포함된 mineral medium 배양액(Starr 1971) (Table 2)에 접종된 유글레나는 조도 2800 Lux, 온도 24±1°C, 광주기 16 : 8 (light : dark)의 비율로 유지하며 배양하였다.

시험물질의 물리화학적 특성에 따른 표준 독성시험방 법을 수립하기 위하여 배양환경 조건에 의한 세포생장 을 측정하였다. 초기 세포밀도 변화에 의한 유글레나 생 장영향은 100 mL 삼각플라스크 또는 20 mL 시험용기에 약 0.2×10⁵, 0.5×10⁵, 그리고 1.5×10⁵ cells mL^-1로 접종 하여 5일간 배양하며 측정하였다. Open과 close 환경에 의한 세포 생장영향은 20 mL 시험용기에 초기 세포밀도 를 약 0.2×10⁵, 0.5×10⁵, 그리고 1.5×10⁵ cells mL^-1로 접종한 후 멸균거즈와 솜을 이용하여 공기가 통하게 한 상태(open)와 공기가 통하지 않도록 마개로 입구를 밀봉 한 상태(closed with head space)로 5일간 배양하며 측정 하였다. 배양액 pH에 의한 영향은 위의 실험과 동일한 조건하에 배양액의 pH를 변화시켜(pH 5, pH 6, pH 7) 수 행하였다. 세포 밀도는 혈구계수판(superior, Germany)을 이용하여 Inverted microscope (CKX41, Olympus, Japan) 로 측정한 뒤 다음과 같은 식에 의해 세포 생장률(cell growth rate, μ)을 산출하였다.

t₀: 시험시작시간(day)

t_n: 시험종료시간(day)

N₀: 조류 초기 세포밀도

N_n: 시간 t_n에서 측정된 세포밀도

3.E. agilis의 생장 저해 시험

5종 유기용매 (acetone, chloroform, dimethyl sulfoxide (DMSO), ethanol, methanol)를 시험물질로 유글레나 생장 저해시험을 수행하였다. 시험은 지수생장기에 도달한 세 포를 이용하여 수행하였으며 실험과정은 다음과 같다. E. agilis (약 1.5×10⁵ cells mL^-1)에 배양액(Table 1)으로 희석한 각 유기용매를 농도별로 처리한 후 공기와 접촉 하지 않은 상태 (closed with head space)로 배양하였다. 96시간 경과 후 세포밀도를 측정하여 다음과 같은 식에 의해 세포 생장 저해율(cell growth inhibition rate)을 산 출하였다.

μ_c : 대조군의 생장률

μ_i : 노출농도 i에서의 생장률

4.V. fischeri시험

V. fischeri시험은 Modern water Microtox^® Analyzer (Model 500, Microtox^®, USA)를 이용하여 다음과 같은 방법으로 분석하였다. 각 시험물질에 총량의 1/10 (v/v)에 해당하는 OAS (osmotic adjusting solution)를 첨가한 후 농도별로 희석한 시료를 준비하였다. 독성영향은 V. fischeri의 초기 발광도와 대조군 및 시료에 노출 5분, 15분, 그리고 30분 경과 후의 발광도를 측정한 후 EC₅₀ (Half maximal effective concentration)을 산출하였다.

5.E. agilis의 세포 반응 시험

시험물질에 의한 E. agilis의 세포반응을 관찰 및 측정 하였다. 세포반응 관찰 시험은 각 시험물질을 처리 후 E. agilis 세포를 현미경(Inverted microscope, CKX41, Olympus, Japan)으로 관찰하였다. 또한 촬영된 세포반응 이미 지(1초에 4번, 총 2분)를 이용하여 E. agilis의 운동성 파 라미터(swimming velocity, motility)를 측정하였다(Tahedl and Häder, 2001).

d=벡터의 길이(1째 화면과 5째 화면의 세포거리, x축 상의 이동거리와 y축상의 이동거리)

Δt: 1째 화면과 5째 화면의 시간 차이

n_s: velocity>v_s인 벡터의 수

n: 모든 벡터의 수

v_s: 활동적으로 움직이는 세포와 활동성이 없거나 바닥 으로 가라앉는 유글레나를 구별하는 최소한의 속도

S: 유글레나 외부길이의 합계 A: 면적(유글레나의 면적)

6.통계처리

대조군과 실험군의 유의성 검정은 students t-test로 비 교하였고 SAS 통계프로그램을 이용하여 95% 신뢰구간 을 포함한 EC₀₅, EC₅₀을 분석하였으며 모든 통계 값에서 유의 수준은 0.05 이하(p<0.05)로 하였다.

결과 및 고찰

1.E. agilis 배양 및 시험조건 수립

생물을 이용하여 환경유해 화학물질에 대한 영향을 평 가할 경우, 시험물질의 노출시기, 노출기간 및 노출방법 등 적용된 시험방법에 따라 생물에게 발현되는 양상이 다양하게 나타날 수 있다. 따라서 본 연구에서는 표준화 된 독성 시험법 개발을 위한 기초연구로 배양액 pH, 배 양용량, 초기접종 세포밀도, 그리고 노출환경조건 (open 혹은 close)에 의한 E. agilis의 생장 영향을 측정하였다.

Fig. 1은 E. agilis의 초기 세포밀도를 1.5×10⁵ cell mL^-1 로 동일하게 유지한 후 배양액의 부피(100 mL 또는 10 mL)와 pH (pH 5, 6, 7) 조건을 변화하여 5일간 측정한 결 과이다. 배양액 pH에 의한 세포 생장속도 변화는 초기접 종 2일 후부터 나타나기 시작하였으며 배양액의 pH가 5인 조건에서 E. agilis는 가장 좋은 성장을 나타내었다 (Fig. 1). 배양용량 차이에 의한 세포 생장율 변화는 없으 며 이와 같은 결과는 적은 용량(10 mL, 총 부피)의 독성 시험이 가능함을 보여준다.

시험물질의 기체압과 헨리상수 값은 독성시험 수행 시 시료가 휘발에 의해 소실되는가를 결정하는 데 중요한 영향인자이므로 휘발성 유기화합물질에 대한 독성시험 을 수행할 경우 시험물질 노출방법이 독성 결과 값에 영 향을 야기할 수 있다. 따라서 휘발성 물질을 함유한 시 료일 경우 일반적으로 close 환경 조건에서 독성실험을 수행하는 것이 바람직하다. 그러나 생물 종에 따라 close 환경의 배양조건이 시험 생물 종의 생장에 영향을 미칠 수 있으므로 독성평가에 있어 방해 요소로 작용할 수 있 다. 특히 미세조류를 생물 종으로 닫힌 조건(closed system) 에서 생장저해를 종말점으로 독성시험을 수행할 경 우 CO2의 고갈과 pH 증가에 의해 조류 생장에 제한을 유발할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 E. agilis를 이용 하여 close 환경에서 시험물질에 대한 독성시험의 적용가 능성을 평가하기 위해 20 mL 시험용기(총 부피: 10 mL) 에 초기 세포밀도를 약 0.2×10⁵, 0.5×10⁵, 그리고 1.5× 10⁵ cellsmL^-1로 접종한 후 open과 close 환경으로 4일간 배양하며 세포 생장영향을 측정하였다. 96시간 경과 후 배양액 pH 및 초기 세포밀도에 의한 생장율의 변화가 관찰되었으나 open과 close 환경에 의한 생장율 변화는 높지 않았다(Fig. 2). 특히 pH 5와 pH 6인 조건에서 초기 세포밀도가 1.5×10⁵ cellsmL^-1일 경우 유사한 세포 생장 율을 나타내었다(Fig. 2). 이와 같은 결과는 E. agilis를 이 용하여 open과 close 환경에서 독성시험 수행이 가능함 을 나타내며 휘발성 유기용매에 의한 독성영향 평가 시 closed system 노출시험이 적합할 것으로 판단된다.

2.E. agilis 생장 저해 시험

5종의 휘발성 유기용매 (acetone, chloroform, DMSO, ethanol, 그리고 methanol)에 대한 E. agilis 생장 저해시험 을 수행하였다. 시험 결과, 시험물질의 농도가 증가할수 록 E. agilis의 세포밀도가 감소하였다(Fig. 3). 시험물질 에 의한 세포독성 영향은 농도 의존성을 나타냈으며 농 도-반응 관계는 Sigmoid 형태를 나타내었다(Fig. 4). 시험 에 사용된 5종의 시료 중 E. agilis는 chloroform에 가장 민감한 반응을 보였으며(Fig. 3, Fig. 4) 용량-반응 곡선과 반수영향농도(EC₅₀)를 비교한 결과 DMSO가 가장 독성 이 낮았고 methanol, ethanol, acetone순으로 독성이 높아 졌으며 chloroform의 독성이 가장 높게 측정되었다(Table 3). Acetone과 ethanol의 최저영향농도(LOEC)는 각각 5.0과 10 mL L^-1이고 E. agilis에 해를 나타내지 않는 최 고 농도를 무영향농도(NOEC)로 가정할 때 DMSO와 methanol의 NOEC는 각각 12.5와 10.0 mL L^-1로 측정되 었다(Table 3).

시험물질에 의한 E. agilis의 독성민감도를 알아보기 위 해 E. agilis 급성 독성영향(EC₅₀, 96 h)과 현재 수 생태 관리제도에 이용되는 생물 종인 D. magna (24 h), 새로운 독성시험평가 종 후보인 국내 서식 물벼룩(M. macrocopa, 24 h)과 V. fischeri의 독성영향과 비교하여 Table 4에 나타내었다. 동일시험물질에 대하여 해양 발광박테리아 (V. fischeri)를 이용한 독성시험을 수행하였고 독성민감 도 비교에 이용된 D. magna와 M. macrocopa의 EC₅₀ 값 은 문헌조사를 통해 얻은 값이다. V. fischeri에 대한 발광 저해시험 결과 EC₅₀ (15 min)을 기준으로 Chloroform의 독성이 가장 높았으며 Acetone>Methanol>Ethanol >DMSO 순으로 독성이 높았다.

E. agilis의 독성민감도는 acetone에 대하여 D. magna 보다 낮았으나 V. fischeri와 유사하였고 M. macrocopa보 다 약 3배 정도 높았다. Chloroform에 대하여 E. agilis는 D. magna 또는 V. fischeri와 유사하였다. DMSO에 대한 E. agilis의 독성민감도는 M. macrocopa와 D.magna에 비 해 약 1.5~9.2배 낮았다. Ethanol에 대한 E. agilis 독성 민감도는 D. magna보다 낮으나 M. macrocopa와 V. fischeri보다 각각 약 1.5와 4.5배 정도 높았다. Methanol에 대한 E. agilis독성민감도는 M. macrocopa와 유사하였고 D. magna보다 낮으며 V. fischeri보다 약 2.5배 정도 높 았다 (Table 4). E. agilis의 독성민감도는 시험물질별로 상이하나 전반적으로 D. magna보다 낮았다. 그러나 M. macrocopa 또는 V. fischeri와 유사하거나 더 민감하였다.

3.E. agilis의 세포 반응 시험

유글레나(E. gracilis)의 동물성 특성을 이용한 독성시 험을 통하여 다양한 유해화학물질은 세포의 형태, 움직 임, 방향성 및 이동속도 등에 영향을 미친다는 연구 결과 가 보고된 바 있다. Cadmium (0.1~1.6mgL^-1)과 tributyl- tin chloride (5.6 mg L^-1)에 의해 세포의 형태 변화가 관찰 되었으며(Ohta et al. 2001; Watanabe and Suzuki 2001), 대 조군 대비 50% 이하의 세포생장 저해를 유발하는 우라 늄 노출에도 세포 밀집 현상과 V-형태의 세포가 관찰되 었다(Trenfield et al. 2012). Danilove와 Ekelund는 구리, 니켈, 납 그리고 아연에 단기 노출(2시간)된 E. gracilis 의 세포의 형태 변화는 민감한 지표가 아니라고 규정하 였으나(Danilove and Ekelund 2001) Ahmed와 Häder는 세 포이동속도(swimming velocity)와 세포방향성(gravitactic orientation)이 세포생장 저해를 유발하는 구리독성에 민 감한 지표라고 제시하였다(Ahmed and Häder 2010a).

이에 본 연구에서는 5종의 시험물질에 대하여 E. agilis 의 세포반응을 관찰하였고 가장 독성이 높은 chloroform 에 대하여 E. agilis 세포의 운동성 변화에 기인된 movement parameters (swimming velocity, motility, compactness) 를 측정하였다. 세포반응 관찰 결과 각 물질의 EC₅₀ (E. agilis, 96 h) 또는 그 이상의 농도에 단 2분 노출되었음에 도 E. agilis 세포의 형태 변화가 나타났다(Fig. 5). 특히 chloroform 노출 후 E. agilis 세포의 움직임을 측정한 결 과 세포의 평균 이동속도 (swimming velocity), 움직임 (motility) 그리고 세포 밀집(compactness)은 대조군에 비 해 각각 73.0, 94.0, 그리고 29.4% 감소하였다(Fig. 6).

본 연구의 결과, E. agilis 세포의 운동성 변화에 기인된 movement parameters (velocity, motility, compactness)를 종말점으로 독성시험을 수행할 경우 시험물질에 대한 세 포의 반응시간이 짧아 단시간 내에 독성영향을 측정할 수 있으므로 실시간 모니터링에 효과적으로 적용될 수 있을 것으로 판단된다.

적 요

본 연구에서는 새로운 국내 생태독성평가 시험 생물 종으로서 유글레나의 적용가능성을 평가하기 위하여 국 내 서식종인 E. agilis를 이용하여 5종의 휘발성 유기용 매(Acetone, Dimethyl sulfoxide (DMSO), Ethanol, Methanol) 에 의한 독성영향을 평가하였다. E. agilis의 식물적 특성을 이용한 급성독성영향 평가 결과, D. magna에 비 해 DMSO에 대한 독성민감도가 상대적으로 낮았으나 전반적으로 비교생물 종과 유사하거나 민감하였다. E. agilis의 동물적 특성을 이용한 세포반응 시험 결과, Chloroform의 경우 반수영향을 야기하는 시험물질농 도(96시간 EC₅₀)에 상당히 신속하고 민감한 독성반응을 나타내었다. 환경시료에 대한 모니터링 목적으로 다양한 생물 종을 이용한 생물검정 기법 적용이 증가하고 있는 추세이다. 수 생태 환경관리를 목적으로 새로운 생태독 성시험 개발에 적용할 생물 종은 국내 수질환경에 적합 하고 배양이 용이하며 다양한 유해화학물질에 대한 독 성이 민감해야 한다. 또한 반응시간이 짧아 실시간으로 모니터링이 가능할 뿐만 아니라 경제성도 고려되어야 한다. 본 연구의 결과 E. agilis는 배양이 용이하고 다루 기 쉬우며 생장율(growth rate), 이동속도(velocity), 활동 도(motility), 세포형태(com-pactness) 등 식물적 특성과 더불어 동물적 특성과 연계된 인자들을 종말점으로 독 성시험을 수행할 수 있다. 따라서 E. agilis는 다양한 유 해화학 물질 및 환경시료에 대하여 신속하고 민감한 독 성반응 도출이 가능할 것으로 예상되며 향후 국내 수질 관리를 위한 새로운 생태독성 영향평가 생물 종으로 적 용될 수 있을 것으로 판단된다.