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ISSN : 1226-9999(Print)
ISSN : 2287-7851(Online)
Korean Journal of Environmental Biology Vol.35 No.2 pp.169-174
DOI : https://doi.org/10.11626/KJEB.2017.35.2.169

Effects of Methyl Ethyl Ketone and Methanol on the Survival and Reproduction of Paronychiurus kimi (Collembola: Onychiuridae)

June Wee, Yun-Sik Lee, Jino Son, Yongeun Kim, Hyoung-ho Mo1, Kijong Cho*
Division of Environmental Science and Ecological Engineering, Korea University, Seoul 02841, Republic of Korea
1Institute of Life Science and Natural Resources, Korea University, Seoul 02841, Republic of Korea
Corresponding author: Kijong Cho, 02-3290-3064, 02-3290-6509, kjcho@korea.ac.kr
May 31, 2017 June 5, 2017

Abstract

Acute and chronic toxicities of methyl ethyl ketone and methanol were investigated on Paronychiurus kimi (Collembola), for evaluating the potential effects of accidental exposures of these chemical substances on the terrestrial environments. This study was undertaken to establish a toxicity database for these chemical substances, which was required for the preparation of the response compensation and liability act for agricultural production and environmental damage. The 7-d acute toxicity and 28-d chronic toxicity were conducted using the OECD artificial soil spiked with varying, serially diluted concentrations of methyl ethyl ketone and methanol. Mortality was recorded after 7-d and 28-d of exposures, and the number of juveniles were determined after 28-d of exposure in the chronic toxicity test. In both assessments, methanol was more toxic than methyl ethyl ketone in terms of mortality (LC50) and reproduction (EC50). The 7-d LC50 of methyl ethyl ketone and methanol were 762 and 2378 mg kg-1 soil dry wt., respectively, and the 28-d LC50s were 6063 and 1857 mg kg-1 soil dry wt., respectively. The 28-d EC50 of methyl ethyl ketone and methanol were 265 and 602 mg kg-1 soil dry wt., respectively. Comparison of results obtained in this study with literature data revealed that P. kimi was more sensitive to methanol than other soil invertebrates. However, given the high volatility of the chemicals tested in this study, further studies are necessary to improve the current test guideline, or to develop new test guidelines for an accurate assessment of chemicals that require toxicity databases for chemical accidents.


메틸에틸케톤과 메탄올이 김어리톡토기의 사망 및 번식에 미치는 영향

위 준, 이 윤식, 손 진오, 김 용은, 모 형호1, 조 기종*
고려대학교 환경생태공학과
1고려대학교 생명자원연구소

초록


    Ministry of Environment
    2016001970003

    서 론

    매년 국내에서는 400여 종의 신규화학물질이 도입되며, 화학물질의 사용 및 유통량이 증가함에 따라 이들 화학물질 의 운반 및 유통 과정에서 사고 발생률이 증가하고 있는 추 세이다 (Suh et al. 2015). 화학물질에 의한 사고 발생 시, 사 고발생지에 물질적, 환경적 피해를 일으킬 뿐만 아니라, 화 학물질의 확산을 통해 사고 발생 지역 주변의 환경과 주민 에게도 피해를 줄 수 있다. 최근 2012년 구미에서 발생한 불 화수소가스 누출사고의 경우 피해지역 복구와 지역주민 지 원을 위하여 364억원을 지원하였으며, 지역주민의 건강검진 은 12,243건에 이르렀다는 보고가 있었다 (Suh et al. 2015). 이처럼 화학사고에 의한 피해는 광범위하게 나타날 뿐만 아 니라 장기적인 영향도 가지고 있어, 사고발생 시 피해예측과 이에 대한 적절한 대응책 마련이 필요한 실정이나 구체적 방안이 마련되어 있지 않은 실정이다 (Korea Environment Institute 2013).

    국내에서는 화학물질관리법 제39조에 따라 화학사고 발 생의 우려가 높거나 화학사고가 발생하면 피해가 클 것으로 우려되는 물질들을 “사고대비물질”로 지정하여 관리하고 있 으며, 화학사고 발생 시, 화학물질관리법 제44, 45조에 따 라 즉시 조사단을 구성하여 화학물질의 유출에 따른 인적, 물적 피해와 환경에 대한 영향을 평가하고 있다. 하지만 화 학사고 후 시료 분석결과와 피해 개체 수 등을 기반하여 환 경피해를 산정하는 미국 및 EU의 산정법 (EPA 2002)과 달 리 국내에서는 피해를 육안감별 (식물의 황화현상 및 괴사 등)에 근거하고 있으며, 환경매체의 피해는 간과하고 있다. 특히 토양에 대한 유해화학물질의 영향과 관련된 법 조항은 부족한 실정이며, 이마저도 각각 유해화학 물질이 토양에 미 치는 영향이나 취약성에 대해서는 대책 마련이 부족한 상황 이다 (Yoo et al. 2016). 또한 화학사고 시 보상 기준과 의사결 정에 매우 중요한 기초 자료들은 매우 부족하여 피해를 규 명하기 어려운 현실이다 (He et al. 2011).

    본 연구의 목적은 사고대비물질에 대한 생태독성평가를 통해서 화학사고가 생태계에 미치는 영향을 정량화하여, 향 후, 화학사고 발생 시 피해보상 기준과 의사결정에 과학적 근거를 제공하는 데 있다. 이를 위해 본 연구에서는 사고대 비물질 중 국내외적으로 토양에 대한 영향 평가가 이루어 지지 않은 메틸에틸케톤과 메탄올을 대상으로 이들 물질이 토양에 미치는 영향을 평가하기 위해 국내 토착 절지동물 인 김어리톡토기 (Paronychiurus kimi)를 이용한 생태독성평 가를 수행하였다. 메틸에틸케톤과 메탄올은 사고대비물질 에 속하는 물질들로 2016년 환경부에서 발표한 ‘2014년 화 학물질 배출량 조사’에서 각각 전체 배출량의 6.3과 5.0%를 차지하며, 배출량 상위 10개 화학물질에 속하였다 (National institute of chemical safety 2017). 많은 배출량과 더불어 2014~2016 3년간 사고 발생건수는 각각 9, 5건으로 2014 년 이전에 비해 발생빈도가 증가하는 추세를 보이고 있다 (National institute of chemical safety 2017). 하지만 메틸에 틸케톤과 메탄올에 대한 연구는 국내외적으로 인체위해성에 초점을 맞추어 수행되어 왔으며, 토양 생태계에 대한 영향을 평가하는 연구는 매우 부족하여 본 연구를 수행하였다.

    톡토기는 토양에 서식하는 절지동물 가운데 가장 풍부한 생물로 (Engel et al. 2004), ISO와 OECD 등의 국제기관에서 제정한 표준지침에 토양질 평가를 위한 표준 종으로써 지난 40년간 오염 물질이 토양에 미치는 영향을 평가하는 데 이 용되어 왔다 (Fountain et al. 2005). 또한 본 실험에서 이용 한 김어리톡토기는 OECD 표준지침에서 표준종인 Folsomia candidaF. fimetaria의 대체 종으로 기재되어 있다 (OECD 2009). 김어리톡토기는 한국의 논 토양에 풍부하게 분포하 면서 분해자로서 중요한 역할을 할 뿐만 아니라 (Son et al. 2007), OECD 표준지침의 대체 종으로서 다양한 오염물질에 대한 평가가 (Kang et al. 2001; Son et al. 2007, 2009) 이루어 져 왔기 때문에 본 연구에 사용되었다.

    재료 및 방 법

    1실험생물

    실험에 사용된 김어리톡토기는 1996년 경기도 이천의 논 에서 채집된 후 (Choi et al. 2002), 20±1℃ 항온기 암조건에 서 사육되어 왔다. 석고, 차콜과 물을 4:1:4 (부피)로 섞어 만 든 현탁액을 페트리디쉬 (95 mm 지름, 15 mm 높이)에 1 cm 깊이로 넣고 건조시킨 배지를 김어리톡토기의 사육에 사용 하였다. 사육 시 배지를 증류수를 이용하여 습윤 시키고, 먹 이로 Brewers’ yeast를 매주 제공하였다 (Snider et al. 1969). 매주 동일한 시점에 성충이 낳은 알을 따로 선별하여, 위에 기술한 방법대로 사육 후, 부화 후 28~30일이 지난 동일한 연령의 성충을 실험에 이용하였다 (Son et al. 2007).

    2시험물질

    메틸에틸케톤 (C2H5COCH3, >99% purity, ACS reagent)은 Sigma Aldrich (St. Louise, MO, USA)에서 메탄올 (CH3OH, >99% purity, HPLC grade)은 J. T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA)에서 구입하여 사용하였다. 급성독성평가에서는 토 양 내 메틸에틸케톤과 메탄올의 농도가 각각 208, 416, 833, 1666, 3332 mg kg-1 soil dry wt.과 423, 2166, 4233, 21166, 42333 mg kg-1 soil dry wt.이 되도록 시험물질과 3차 증류 수와 혼합하여 수용액 상태의 저장용액 (Stock solution)을 제조하여 준비하였다. 만성독성평가에서는 토양 내 메틸에 틸케톤과 메탄올의 농도가 각각 46.875, 93.75, 187.5, 375, 750, 1500 mg kg-1 soil dry wt.과 156.25, 312.5, 625, 1250, 2500, 5000 mg kg-1 soil dry wt.이 되도록 시험물질과 3차 증 류수와 혼합하여 수용액 상태의 저장용액 (Stock solution)을 제조하여 준비하였다.

    3김어리톡토기 (Paronychiurus kimi)를 이용한 생태독성평가

    본 실험에서는 대상 시험물질이 성충의 사망에 미치는 7 일 급성독성평가와 OECD 표준지침 232 (OECD 2009)를 기 반으로 성충의 산란수에 미치는 28일 만성독성평가를 진행 하였다. 시험에 사용된 인공 토양은 건조 중량 기준으로 가 늘게 분쇄된 5% Sphagnum peat, 20% 카올린 및 75% 모래 로 조성된 토양을 이용하였고, 토양 산도는 탄산칼슘을 이 용하여 6.0±0.5로 조절하였다. 토양 수분함량은 토양보수력 (Water Holding Capacity)의 50%로 조절하기 위해 앞서 상 이한 농도로 제조된 메틸에틸케톤과 메탄올 수용액과 3차증 류수를 토양에 넣고 균일하게 교반하여 준비하였다. 처리군 은 각 농도에서 교반된 토양 30 g (습윤 중량기준)을 폴리스 틸렌 용기에 넣어 준비하였고, 대조군은 3차 증류수를 이용 하여 준비하였다. 각 농도당 5반복으로 수행하였다. 급·만 성독성평가시 노출기간 동안, 시험 용기는 20±1℃ 항온기, 암조건에서 유지되었고, 토양 수분의 함량은 3차 증류수로 중량 손실을 보충하여 매주 조정 하였다. 급성독성평가에서 는 실험기간 동안 추가적으로 먹이를 제공하지 않았고, 만성 독성평가에서는 먹이로 적당량의 Brewers’ yeast를 격주 제 공하였다. 급성독성평가에서는 실험종료 시 토양에 적당량 의 물을 부어 부유된 성충의 수를 계수하였고, 만성독성평가 에서는 실험종료 시 부유된 성충과 유충의 수를 계수하였다.

    4통계 분석

    모든 통계분석은 통계프로그램 SAS 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하였다. 통계 분석에 앞서 만 성독성실험의 산란수 자료는 각 처리농도에서 반복수간 의 이상치 (outlier)를 MAD (median absolute deviation) 방 법을 이용하여 제거 후 분석하였다 (Leys et al., 2013). 급· 만성독성실험 수행 후 대조군과 처리군의 사망률을 비교 하기 위해, 일원배치분산분석을 수행하였고, 사후검정으로 Tukey 검정법을 이용하여 유의수준 5%에서 분석하였다. 만 성독성실험 수행 결과에 대해 반수치사농도 (LC50, median lethal concentration)와 95% 신뢰구간은 Probit 모델을 이 용하여 분석하였으며, 산란수에 대한 반수영향농도 (EC50, effective concentration 50%)와 95% 신뢰구간은 Haanstra et al. (1985)가 제안한 로지스틱모형을 이용하여 적합하였다. 산란수에 대한 무영향관찰농도 (NOEC, no observed effect concentration)와 최소영향관찰농도 (LOEC, lowest observed effect concentration)는 일원배치분산분석을 수행 후, 사후검 정으로 Dunnett검정법을 이용하여 산출하였다.

    결과 및 고 찰

    1메틸에틸케톤과 메탈올이 김어리톡토기 사망 및 산란에 미치는 영향

    메틸에틸케톤에 대한 급성독성평가 결과 LC50 값은 762 mg kg-1 soil dry wt. (Table 1)이었으며, 833 mg kg-1 soil dry wt. 이상의 농도에서 사망률이 대조군과 통계적으로 유의한 차이를 보였다 (Fig. 1). 메틸에틸케톤에 대한 만성독성평가 결과 LC50 값은 6063 mg kg-1 soil dry wt. (Table 1), EC50 값 은 570 mg kg-1 soil dry wt., NOEC와 LOEC 값은 각각 375 와 750 mg kg-1 soil dry wt.였다. 메탄올에 대한 급성독성평 가 결과 LC50 값은 2378 mg kg-1 soil dry wt. (Table 1)으로 메틸에틸케톤에 비해 낮은 독성을 보였으며, 2166 mg kg-1 soil dry wt. 이상의 농도에서 사망률이 대조군과 통계적으로 유의한 차이를 보였다 (Fig. 1). 메탄올에 대한 만성독성평가 결과 LC50 값은 1857 mg kg-1 soil dry wt. (Table 1)이었으며, 2500 mg kg-1 soil dry wt. 이상의 농도에서 대조군과 유의한 차이를 보였다 (Fig. 2). 28일 후 성충이 낳은 유충의 수는 농 도에 따라 Sigmoid 형태의 농도의존적 감소추세를 보였으며 (Fig. 3), EC50 값은 589 mg kg-1 soil dry wt., NOEC와 LOEC 값은 각각 156.25와 312.5 mg kg-1 soil dry wt. (Table 2) 으로 메틸에틸케톤과 유사한 결과를 보였다.

    메틸에틸케톤의 경우 토양에서 절지동물에 대한 독성평가 결과는 없었지만, Mayer et al. (2001)은 1시간 동안 100 mL L-1 에서 꿀벌 Apis mellifer이 기피 행동을 보이지 않았다고 보고했으며, Reynolds. (1977)는 상추 Lactuca sativa의 발아 에 대한 72시간 EC50 값을 12.5 mM로 보고하였다. 메탄올의 경우, 종래에 보고된 토양 메탄올에 대한 결과와 본 연구결 과를 비교했을 때, Stantec consulting Ltd. (2006)이 붉은줄지 렁이 (Eisenia andrei)와 장님마디톡토기 (Folsomia candida) 에 대해 보고한 LC50 값과 EC50 값들은 각각 17199.10 mg kg-1와 26646.05 mg kg-1, >10000 mg kg-1와 EC50 of 5683.53 mg kg-1로 본 실험결과와 최소 5배 이상의 차이를 보였다. 이러한 결과는 P. kimi가 종래의 다른 토양 절지동물 에 비해 메탄올과 메틸에틸케톤에 대해 높은 민감도를 갖는 것으로 판단된다. 본 실험의 결과는 Frampton et al. (2006)Daam et al. (2011)이 다양한 농약에 대한 급·만성독성평가 에서 톡토기가 지렁이보다 민감하다고 보고한 결과와, 중금 속에 대하여 F. candida에 비해 P. kimi가 민감하다고 보고한 Son et al. (2007)의 결과와 유사한 경향을 보이는 것을 확인 할 수 있었다. 국내 토착 절지동물이면서 다양한 화학물질에 민감한 P. kimi는 사고대비물질들이 토양에 미치는 영향을 파악하는 데 적합한 것으로 사료된다.

    본 연구에서 적용된 OECD 표준지침에서는 휘발성이 큰 (Henry’s constant>1 or Vapor pressure>0.0133 Pa at 25℃) 물질에 대해 평가 및 적용의 제한을 권고하였으나 (OECD 2009), 아직까지 정확한 표준지침은 마련되어 있지 않은 실 정이다. 그러나 현재까지 이들 사고대비물질에 대한 생태독 성정보의 부재와 더불어 대부분의 사고대비물질들이 큰 휘 발성을 가지고 있는 점을 감안할 때, 이러한 사고대비물질에 대한 정확한 평가를 위해서는 종래의 표준지침을 개선하거 나 새로운 평가지침 마련을 통해 지속적인 생태독성정보구 축을 위한 더 많은 연구가 필요하다.

    적 요

    화학사고 발생 시 환경에 노출된 화학물질이 생태계에 미 치는 영향을 평가하기 위하여, 우리나라에서 서식하는 김어 리톡토기 (Paronychiurus kimi)를 이용하여 OECD guidelines 232 Collembola reproduction test in soil에 따라 사고대비물 질 2종, 메틸에틸케톤과 메탄올에 대한 급성, 만성 생태독 성평가를 진행하였다. 메틸에틸케톤과 메탄올을 농도별로 OECD 인공토양과 섞은 후, 성충 P. kimi 10마리를 접종하여 7일 후의 성충 사망률과, 28일 후의 성충 사망률 및 번식률 을 확인하였다. 메틸에틸케톤과 메탄올에 대한 급성독성평 가 결과, LC50 값은 각각 2378과 762 mg kg-1 soil이었으며, 만성독성평가 결과, LC50 값은 각각 1857과 6063 mg kg-1 soil이었다. 만성독성평가 시 P. kimi의 산란 수에 대한 EC50 값은 메틸에틸케톤에서 570 mg kg-1 soil, 메탄올이 589 mg kg-1 soil로 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 본 연 구의 결과 P. kimi가 종래의 다른 토양 절지동물에 비해 메탄 올에 대해 높은 민감도를 갖는 것으로 판단되었다. 현재까지 이들 사고대비물질에 대한 생태독성정보의 부재와 더불어 대부분의 사고대비물질들이 큰 휘발성을 가지고 있는 점을 감안할 때, 이러한 사고대비물질에 대한 정확한 평가를 위해 서는 종래의 표준지침을 개선하거나 새로운 평가지침 마련 을 통해 지속적인 생태독성정보구축을 위한 더 많은 연구가 필요하다.

    사 사

    본 연구는 환경부의 "화학사고 대응 환경기술개발사업" (2016001970003)에서 지원받았습니다.

    Figure

    KJEB-35-169_F1.gif

    Mean numbers (per container) of survivors of Paronychiurus kimi adults 7-d after exposure to methyl ethyl ketone (A), and methanol (B) in artificial soil. Ten adults were initially inoculated in each container. Different letters in each graphic panel represent significant differences between treatments (Tukey’s post hoc tests, p=0.05).

    KJEB-35-169_F2.gif

    Mean numbers (per container) of survivors of Paronychiurus kimi adults 28-d after exposure to methyl ethyl ketone (A) and methanol (B) in artificial soil. Ten adults were initially inoculated in each container. Different letters in each graphic panel represent significant differences between treatments (Tukey tests, p=0.05).

    KJEB-35-169_F3.gif

    Numbers of offspring produced by adult P. kimi 28-d after exposure to methyl ethyl ketone (A) and methanol (B) in artificial soil. The relationship between juvenile production and concentration of methyl ethyl ketone or methanol was fitted using the logistic model presented by Haanstra et al. (1985).

    Table

    LC50 estimates (mg kg-1) with 95% confidence limits for the effects on survival of adults P. kimi 7- and 28-d after exposure to different concentration of methyl ethyl ketone and methanol in artificial soil

    28-d EC50 estimates (mg kgM-1) with 95% confidence limits, NOEC (no observed effective concentration) and LOEC (lowest observed effective concentration) (mg/kg) for the effects on reproduction of adult P. kimi exposure to different concentration of methyl ethyl ketone and methanol in artificial soil

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