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ISSN : 1226-9999(Print)
ISSN : 2287-7851(Online)
Korean Journal of Environmental Biology Vol.35 No.2 pp.207-214
DOI : https://doi.org/10.11626/KJEB.2017.35.2.207

Analysis of Seed Storage Data and Longevity for Agastache rugosa

Mi Hyun Lee, Sun Hee Hong1, Chae Sun Na2, Jeong Gyu Kim1, Tae Wan Kim, Yong Ho Lee1*
Department of Plant Life and Environmental Science, Hankyong National University, RDA, Wanju 17549, Republic of Korea
1O-Jeong-Eco-Resilience Institute, Seoul 02841, Republic of Korea
2Institute of Botany, University of Innsbruck, Innsbruck, A-6020, Austria
Corresponding author:Yong Ho Lee, 02-3290-3462, 02-3290-3502, yonghoyongho@hotmail.com
June 5, 2017 June 16, 2017 June 16, 2017

Abstract

There is little information about the seed longevity of wild plants, although seed bank storage is an important tool for biodiversity conservation. This study was conducted to predict the seed viability equation of Agastache rugosa. The A. rugosa seeds were stored at moisture contents ranging from 2.7 to 12.5%, and temperatures between 10 and 50℃. Viability data were fitted to the seed viability equation in a one step and two step approach. The A. rugosa seeds showed orthodox seed storage behaviour. The viability constants were KE=6.9297, CW=4.2551 CH=0.0329, and CQ=0.00048. The P85 of A. rugosa seeds was predicted to 152 years under standard seed bank conditions. The P85 predicted by seed viability equation can be used as basic information for optimization of seed storage processes.


배초향 (Agastache rugosa) 종자의 저장 반응과 수명 분석

이 미현, 홍 선희1, 나 채선2, 김 정규1, 김 태완, 이 용호1*
국립한경대학교 식물생태환경과학과
1고려대학교 오정에코리질리언스 연구소
2인스부르크대학교 식물연구소

초록


    Korea Forest Service
    2014S1100006

    서 론

    기후변화와 급격한 산업화로 인한 생태계 교란은 많은 식물들의 멸종을 야기하고 있다. 장기저장시설에서의 종자 저장을 통한 서식지외 보존 전략은 멸종되어가는 식물의 복원을 위한 매우 효율적인 전략이다. 하지만 이러한 복원이 성공적으로 수행되기 위해서는 보관된 종자 유전자원이 활력이 유지되고, 유전적 다양성이 보존되어 있어야 한다. 이를 위해서 종자 보관시설은 건조, 저장, 모니터링, 갱신으로 이루어진 종자 처리체계를 구축하고 있다 (Cochrane et al. 2007; Crawford and Monks 2009). 이러한 종자 처리체계는 비교적 종자의 활력과 품질이 균일한 재배식물의 종자 특성에 기반하여 구성되었으며, 최근에는 야생식물 종자 관리에도 적용하고 있다. 하지만 야생식물 종자는 재배식물에 비하여 많은 양을 수집하는 것이 어렵고, 낮은 활력과 유전적 순도, 높은 휴면율, 생태연구에 대한 결여 등의 특징을 지니고 있어 기존 종자 처리체계의 적용에 어려움이 있다 (Hamilton 1994; Merritt and Dixon 2011).

    저장 종자는 저장 기간 중 자연적으로 활력을 상실하며, 유전자원의 소실 방지를 위해서는 지속적으로 활력을 모 니터링하고, 기준보다 낮아진다면 갱신을 수행하여야 한다 (Lingington and Manger 2014). 하지만 야생식물 종자는 재 배식물에 비하여 수집되는 양이 매우 적을 수 있기 때문에 모니터링으로 인한 종자 손실은 치명적이다. 또한 휴면으로 인하여 정확한 활력 측정도 쉽지 않아, 재배식물에 비하여 모니터링 또한 많은 비용과 노력이 소모된다. 종자 수명의 정확한 예측은 이러한 종자의 관리를 효율적으로 만들어 줄 수 있다.

    종자는 저온과 건조에 대한 저항성이 강한 진정종자 (Orthodox seed)와 건조에 대한 저항력이 약한 비진정종자 (Recalcitrant seed)로 구분이 가능하다. 이 중 비진정종자는 일반적인 장기저장조건에서 활력을 상실하기 때문에 단명 종자로 취급되며, 종자은행과 같은 장기저장시설을 활용한 보전전략에 적합하지 않다. 진정종자의 수명은 저장온도와 수분함량에 영향을 받는다고 알려져 있으며 일반적으로 낮 은 저장온도, 낮은 수분함량에서 수명이 길어진다 (Roberts 1973). 이에 따라 국제적으로는 15℃, 상대습도 15%의 조 건에서 건조, 밀봉된 상태로 - 20℃에서 저장하여 장기저장 을 시도하고 있다 (Crawford et al. 2007; Probert et al. 2009; Godefroid et al. 2010). Ellis와 Roberts (1980)는 특정 저장온 도 (t, ℃)와 수분함량 (% fresh weight)에서의 시간 (p, days) 에 따른 종자 활력 (v, probits)의 변화에 대한 연구를 수행하 여 종자 활력 공식 (seed viability equation)을 제시하였다. 저 장 기간에 따른 활력 감소를 수식화 하면 다음과 같다.

    v  = K i  - p/σ
    (1)

    여기에서 v는 probit으로 변환된 활력, Ki는 종자의 저장 최초 활력, p는 저장 기간 그리고 σ는 1 표준편차의 활력이 감소되는 데 걸리는 시간으로 종자 수명의 지표이다. σ는 저 장 온도와 수분함량에 영향을 받으며 그 공식은 다음과 같다.

    log 10 σ =  K E  -  C w log 10 m -  C H t -  C Q t 2
    (2)

    여기에서 KE, CW, CH, CQ는 종 특이 계수이며, m은 수분 함량, t는 저장온도이다. 공식 (1)에 공식 (2)를 대입하면 다 음의 종자 활력 공식을 도출할 수 있다.

    v =  K i  -  p/10 K E  -  C w log 10 m -  C H t -  C Q t 2
    (3)

    종자 활력 공식을 예측하기 위해서는 다양한 저장온도, 종 자 수분함량 조건에서 저장 반응을 시험한다. 식물 종의 종 자 활력 공식의 계수를 예측하기 위한 방법으로는 저장 반 응 데이터를 공식 (3)에 비선형 회귀분석을 수행하여 도출 하는 One-step 접근법과 공식 1을 활용하여 저장조건별 σ를 도출하고 공식 2에 회귀분석을 수행하는 Two-step 접근법이 있다. 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 생태형 간의 종자 활 력 공식 계수 예측에 대한 두 접근법의 비교에서는 One-step 접근법이 더 낮은 표준오차를 보여 더 나은 예측 결과를 도 출한 보고가 있다 (Hay et al. 2003).

    종자 활력 공식은 건조, 저장조건이 종자 수명에 미치는 영향을 평가하는 효과적인 수단이다. 활력 공식을 활용한 P50의 예측값 또한 Gene bank의 실제 저장 데이터와 비교 하였을 때 신뢰성이 있는 것으로 보고되었다 (Walters et al. 2005; Hay et al. 2012). 지금까지 활력 공식이 발표된 많은 종들은 대부분 작물이며, 온도에 대하여 Universal constants 를 활용하였다 (Dickie et al. 1990). 하지만 한반도 식물 종자 수명에 대한 연구는 지금까지 거의 이루어지지 않았으며, 특 히 한반도 야생식물의 저장 반응, 저장조건에 대한 연구는 보고된 바 없다. 종자 저장기관의 종자 처리과정에서 종자의 수분함량을 측정하는 것은 매우 중요하다. 하지만 전통적인 오븐법을 활용한 종자의 수분함량 측정은 많은 종자의 소모 를 야기하며 이는 비교적 적은 양이 수집되는 야생식물 종 자의 특성 상 적용하기 쉽지 않다. 종자는 상대습도에 따른 수분함량 변화 양상을 보이며 이는 등온흡습곡선으로 나타 난다. 종자의 등온흡습곡선을 확보한다면, 종자의 평형상대 습도를 측정함으로써 수분함량을 비파괴로 예측할 수 있으 며, 이를 통하여 종자 활력 공식에도 활용할 수 있다 (Probert 2003).

    본 연구에서는 경기도 남양주시에서 수집된 꿀풀과의 배 초향 (Agastache rugosa) 종자의 다양한 저장온도와 수분함량 에 따른 저장 반응을 시험하고, 종자 활력 공식을 예측하였 다. 또한 평형상대습도에 따른 수분함량을 측정하여 종자 등 온흡습곡선 또한 예측하였다. 이를 활용하여 야생식물 종자 저장기관에서 활용 가능한 기초 데이터를 제공하고자 한다.

    재료 및 방 법

    1실험 종자

    실험에 사용된 배초향 종자는 고려대학교 야생자원식물 종자은행에서 분양받아서 활용하였다. 실험종자는 2013년에 경기도 남양주에서 수확 후 음건하여 실험 전까지 - 20℃에 보관하였다.

    2종자 노화 실험

    배초향 종자의 노화 실험은 2015년에 수행하였다. 배초 향 종자를 5조건의 온도 10, 20, 30, 40, 50℃, 9조건의 상대 습도 11, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80% 조합으로 저온, 저습 조건을 제외한 총 32조건에 저장한 후 저장 기간에 따른 활 력의 변화를 검정하였다. 상대습도는 다양한 농도의 Lithium Chloride (LiCl) 용액을 유리 밀폐용기에 넣어 조절하였다 (Gold and Manger 2008; Gold and Hay 2014). 각각의 상대 습도 용기는 HOBO Temp/RH Data Logger (Onset)를 활용 하여 온도와 상대습도를 모니터링하였다. 종자는 망에 담아 각각의 조건별로 저장하여 기간별로 50립씩 2반복으로 꺼내 어 활력 검정을 수행하였다. 발아 시험은 1% Agar 배지에 치 상하여 6주 동안 발아율을 조사한 후, 발아를 하지 않은 종 자는 4℃에서 6주 동안 저온 습윤처리를 수행하여 휴면을 타파하여 주었다. 휴면타파 후, 다시 4주 후에 발아율을 확 인하였다. 유근이 2 mm 이상 돌출된 종자를 발아로 판정하 였다. 발아한 종자+휴면처리 후 발아한 종자를 활력이 있는 종자로 판단하였으며 발아되지 않은 종자는 Crush test를 수 행하여 죽은 종자를 판정하였다.

    3종자 등온흡습곡선 추정

    상대습도별 평형종자 수분함량의 관계에 대한 모델인 등 온흡습곡선 (Seed moisture sorption isotherm)을 이용하면 종자를 소모하지 않고 평형상대습도를 측정하여 종자의 수 분함량 (F.B.)을 추정할 수 있다. 등온흡습곡선의 예측을 위 하여 다양한 온도와 습도별로 저장된 조건별로 종자의 수 분함량 측정을 위하여, ISTA의 Oven method를 활용하였 다 (105℃, 17 hr) (ISTA 2007). 조사된 상대습도별 수분함량 은 D’Arcy-Watt model에 회귀분석을 수행하였다 (공식 4) (Vertucci and Leopold, 1987).(4)

    WC  = K ×  K  ×  RVP 1+ ( K  ×  RVP ) + ( c  ×  RVP ) + k ×  k  × RVP 1 + ( k  ×  RVP )
    (4)

    여기에서 WC는 수분함량 (D.B.) (WC=MC (F.B.)/(100- MC (F.B.)), Kʹ와 K는 강한 흡착수와 관련된 계수, c는 약한 흡착수와 관련된 계수, kʹ와 k는 자유수 관련 계수, RVP는 상대 수증기압 (RH/100)이다.

    4통계 분석

    등온흡습곡선의 예측을 수행하기 위하여 32조건의 상대 습도별 수분함량 데이터를 D’Arcy-Watt model에 비선형 회 귀분석을 수행하였다. 이를 위하여 Sigmaplot 10.0 (Systat software)의 Dynamic fit wizard를 활용하였다.

    32조건의 저장 실험 데이터는 One step, Two step 모델에 대하여 각각 선형, 비선형 회귀분석을 수행하였다. 종자 활 력 공식의 온도 계수들 (CH, CQ)은 독립적인 예측과 여러 가지 종들에 보편적으로 사용되고 있는 Universal constants (CH=0.0329, CQ=0.00048)를 활용한 예측을 모두 수행하 였다. 종자 활력 공식의 계수를 예측하기 위한 2가지 접근법, 2가지 온도계수 종류, 총 4종류의 모델은 F-teat의 Residual mean square 값을 활용하여 데이터에 대한 적합도를 평가하 였다. 저장 실험 데이터의 선형, 비선형 회귀분석은 SAS 9,4 (SAS Institute Inc)의 PROC REG와 PROC NLIN을 활용하 여 수행하였다.

    배초향의 예측된 종자 활력 공식을 실제 종자은행에서 활 용하기 위하여 활력이 85%, 50%, 35%로 감소하는 데 걸리 는 시간을 예측하였다. 종자의 수분함량은 일반적인 종자 건 조 지표인 수분함량 5%, 종자은행 표준 건조조건인 15℃ RH 15%, 건조 시설이 아닌 일반적인 조건에서의 건조조건 인 20℃, RH 50%에서의 평형이 이루어진 종자를 가정하여 등온흡습곡선으로 추정하였다. 최초의 발아율은 99%로 가 정하였으며, 4가지 모델 모두 예측을 수행하여 각 모델 간의 차이를 분석하였다.

    결과 및 고 찰

    1배초향 종자의 등온흡습곡선

    배초향의 종자 등온흡습곡선을 예측한 결과 상대습도의 증가에 따라 수분함량의 증가가 나타났다 (Fig. 1). 배초향 의 지질 함량은 33.8%으로 벼와 옥수수와 같은 전분종자에 비하여 높은 지질함량이 나타났으며 상대습도 11~85% 사 이에서 2.7~12.5%의 수분함량 변이가 나타났다. 상대습도 11%~65%까지는 비교적 선형의 증가를 그 이상부터는 수 분함량의 빠른 증가를 보였다. 하지만 전형적인 종자의 등온 흡습곡선 형태인 S형태 중 낮은 상대습도에서 나타나는 수 분함량의 빠른 감소 (Phase Ⅰ)는 관찰되지 않았다. 이는 현 재 실험된 상대습도 11% 이하에 단분자층 수분함량이 형성 됨을 보여준다. 그 이하부터 빠른 수분함량 감소가 시작되 는 단분자층 수분함량은 건조된 시료의 지질 산화, 효소 활 성 등에 대한 물리적 화학적 안성성의 지표가 되며 최적 건 조 저장조건의 단서를 제공해준다 (Vertucci and Roos 1993; Rockland and Stewart 2013). 이러한 결과는 배초향 종자 는 랜틸콩이 상대습도 27%에서, 고무나무 종자가 상대습도 30%에서 단분자층 수분함량 비하여 낮은 상대습도 조건에 서 단분자층 수분함량이 형성되며, 11%보다 더 낮은 상대습 도 조건에서도 과건에 의한 피해가 없을 수 있음을 보여준 다. 국제적으로 종자 표준 건조조건은 15℃, 상대습도 15% 로 제시되고 있다 (Lingington and Manger 2014). 이는 대부 분의 진정종자에서 적절한 수준의 건조조건으로 많은 야생 식물 종자은행에서 적용되고 있으나, 본 결과에 비추어 보았 을 때, 이러한 획일화된 건조조건은 일부 종에는 과건이 발 생하거나, 최적 건조에 못 미칠 가능성이 있으므로 나아가 배초향과 같은 야생 식물종 종자들의 등온흡습곡선에 대한 데이터베이스 구축이 필요하다 (Lee et al. 2015). 이를 통하 여 저장에 최적화된 종자 건조기술을 확보할 수 있을 것으 로 사료된다.

    2배초향 종자의 활력 공식 예측

    배초향 종자의 32조건의 독립된 저장 실험에 대하여 활력 의 감소 양상에 대하여 분석하였다. 그 결과 10℃의 4조건을 포함한 총 8조건에서는 의미 있는 활력의 감소가 관찰되지 않았다 (Table 1). 이 데이터들은 종자 활력 공식 계수를 예측 하는 데 사용되지 않았다. Log 수분함량에 대한 Log 수명 (σ) 의 영향은 선형 반응을 보였다. 하지만 낮은 상대습도 조건 (RH 11%)의 수명은 예측값보다 비교적 낮게 나타났다 (Fig. 2). 이는 배초향 종자의 낮은 상대습도에서의 저장 생리의 변화 가능성을 보여주며 이에 대한 생리적 분석 연구가 필 요하다. 하지만 높은 상대습도 조건에서는 뚜렷한 양상이 확 인되지 않았다. 온도에 대한 수명의 반응은 2차 선형 반응을 보였으며, 모델의 예측값에 대하여 특별한 경향이 나타나지 않았다 (Fig. 3). 이러한 결과는 배초향 종자가 진정 종자임을 보여준다.

    배초향 종자의 저장조건별 시간에 따른 활력 감소는 예측 된 종자 활력 곡선을 활용하여 예측되었다 (Fig. 4). 높은 온 도, 높은 수분함량에서는 비교적 모델과 비슷한 경향이 관찰 되었으나, 낮은 온도, 낮은 수분함량에서는 데이터의 변이가 크게 나타나는 경향이 관찰되었다. 이는 야생 종자인 배초향 종자가 지닌 휴면, 활력의 불균일성과 같은 요인에 의한 것 으로 판단된다. 향후 다양한 수집 종들의 수명 연구, 정밀한 활력 검정 기술의 개발을 통하여 야생식물들의 예측의 정확 성을 높일 수 있을 것이다.

    배초향 종자의 수명 공식의 계수를 산출하기 위한 4가지 방법에 대한 비교 결과 온도계수를 독립적으로 예측하였을 때는 F-value가 유의성이 없었으며, CH 계수 또한 음수의 값 이 도출되어 활용에 문제가 있었다. 온도계수를 Universal constant를 사용한 예측 방법 중에서는 Two step model이 One step model에 비하여 낮은 Residual mean square가 나타 나 온도계수를 Universal constant를 사용한 Two step model 을 최종적으로 선발하였다 (Table 2).

    3배초향 종자의 종자은행에서의 저장 기간 예측

    배초향 종자의 저장 기간을 예측하기 위하여 종자은행에 서의 표준 조건에서의 건조, 저장이 이루어졌을 때를 포함하 여 9가지의 건조, 저장조건에서의 P85, P50, P35를 예측하였 다. 또한 예측 방법을 달리했을 때의 영향을 평가하기 위하 여 one step과 two step 예측에서 도출된 모형 간의 값들도 비교하였다. 그 결과 두 모형 모두 종자은행에서의 표준 조 건에서 가장 긴 저장 기간을 보였다. 종자은행의 표준 건조 조건에서 건조된 배초향 종자의 P85는 Two step 모형에서 종자은행 장기저장조건 (- 20℃)이 196년으로 예측되었으 며, 종자은행 단기저장고 조건 (5℃)에서는 45년, 상온 (20℃) 에서는 9년으로 예측되었다. 그에 비하여 상온, 일반 상대습 도조건에서 건조된 배초향 종자의 P85는 저장 온도별로 13, 3, 1년으로 나타나 10배 이상의 상당한 수명의 차이가 나타 났다. Table 3

    같은 데이터를 활용하여 예측 방법만을 다르게 한 one step model과 two step model의 비교 결과 - 20℃ 표준 종자은행 조건에서 P85가 one step 모형이 560년 two step 모형이 196 년으로 one step 모형이 2.8배 높게 나타났다. 이는 향후 활 력 공식을 활용한 수명 예측을 종자은행 운영에 활용할 때 활력 공식의 예측 방식 선정의 중요성을 보여준다.

    종자 활력 공식에 대한 연구는 다양한 종, 품종들에 대 하여 수행되어 왔다. 현재까지 26과 66종의 수명 데이터들 이 보고되었으나 그중 3분의 1은 콩과와 벼과이다 (Ellis and Roberts 1980; Pritchard and Dickie 2003). 이는 벼과, 콩과의 작물 종들이 경제적 중요성이 높아 우선적으로 연구가 수행 되었으며, 연구재료로서의 품질 좋은 종자의 확보가 용이하 기 때문이다. 야생식물 종자의 연구는 비교적 최근에 수행 되기 시작하였으나, 야생식물 종자는 연구를 수행할 정도로 품질과 양을 확보하기 어려우며, 휴면 기작들에 대한 기해 부족으로 정확한 활력의 측정이 어렵고, 연구의 기간이 오 래 걸리기 때문에 그 결과의 수가 작물에 비하여 매우 부족 하다 (Hay and Probert 2013). 하지만 수집이 어렵고, 저장되 는 양이 적은 야생식물의 특성 상 일반적인 작물 종자의 장 기저장 프로세스와는 다르게 빈번한 모니터링이 불가능하기 때문에 저장 시점에 최적 저장을 위한 전처리를 추구하여야 하며, 수명 예측을 활용하여 갱신 시기, 모니터링 시기의 최 적화가 필요하다 (Rao et al. 2006; Hay et al. 2012). 배초향 종자의 활력 공식 예측 결과 도출된 P85는 이러한 프로세스 의 최적화의 기준으로 활용 가능할 것으로 사료된다.

    적 요

    본 연구에서 배초향 종자의 다양한 저장조건에서의 활력 변화를 조사하여 종자 등온흡습곡선, 활력 공식을 예측하였 다. 그 결과 배초향의 등온흡습곡선은 전형적인 S 형태로 나 타났으나 Phase Ⅰ이 관찰되지 않아 상대습도 11% 이전에서 단분자층 수분함량이 형성될 것으로 보인다. Log 수분함량 에 대한 Log 수명 (σ)의 영향은 선형 반응을 보였다. 하지만 낮은 상대습도 조건 (RH 11%)의 수명은 예측값보다 비교적 낮게 나타났다. 온도에 대한 수명의 반응은 2차 선형 반응을 보였으며, 모델의 예측값에 대하여 특별한 경향이 나타나지 않았다. Universal constant를 사용하는 Two step model을 활 용한 배초향 종자 활력 공식의 예측 결과 높은 온도, 높은 수 분함량에서는 비교적 모델과 비슷한 경향이 관찰되었으나, 낮은 온도, 낮은 수분함량에서는 데이터의 변이가 크게 나타 나는 경향이 관찰되었다. 이는 야생 종자인 배초향 종자가 지닌 휴면, 활력의 불균일성과 같은 요인에 의한 것으로 판 단된다. 배초향 종자의 활력 공식을 활용한 P85예측 결과 종 자은행에서의 표준 조건에서 가장 긴 저장 기간을 보였다. 종자은행의 표준 건조조건에서 건조된 배초향 종자의 P85는 종자은행 장기저장조건 (- 20℃)이 196년으로 예측되었다. 하지만 one step 모형에서는 P85가 560년으로 예측되어 활 력 공식의 예측 방식 선정의 중요성을 보여줬다. 배초향 종 자와 같은 야생식물은 대량의 연구재료를 확보하기 쉽지 않 기 때문에 일반적인 작물 종자 장기저장 프로세스와는 다르 게 수명 예측을 활용하여 갱신 시기, 모니터링 시기의 최적 화가 필요하다. 본 결과로 도출된 배초향 종자의 P85는 이러 한 프로세스의 최적화의 기준으로 활용 가능할 것으로 사료 된다.

    사 사

    본 연구는 산림청 (과제번호: 2014S1100006)의 지원에 의 해 수행되었음.

    Figure

    KJEB-35-207_F1.gif

    Seed moisture sorption isotherm of Agastache rugosa.

    KJEB-35-207_F2.gif

    Relationship between seed moisture content (% F.B.) and seed longevity (Log10σ, days) for Agastache rugosa seeds. The slope of line represents the moisture parameter (Cw) of seed viability equation.

    KJEB-35-207_F3.gif

    Relationship between storage temperature (℃) and seed longevity (Log10σ, days) for Agastache rugosa seeds. The line represent a regression model with universal temperature parameter (CH, CQ) of the seed viability equation.

    KJEB-35-207_F4.gif

    Survival data and estimated longevity models for Agastache rugosa seeds stored at (A) 20℃ and (B) 40℃. Seed viability equation derived from the one step model with universal temperature constants.

    Table

    Aging experiment conditions (temperature, moisture content), sample number and estimates of initial viability (Ki) and seed longevity (σ) of Agastache rugosa

    ND, No decline in viability was detected

    One step and two step estimation of the viability equation parameters for Agastache rugosa, using either independent estimates of the temperature constants (CH and CQ) or universal constants (CH=0.0329, CQ=0.00048)

    ns, not significant
    **significant at P<0.01

    Estimation of σ (years), P85, P50 and P35 (years) for Agastache rugosa seeds, using the seed viability equation with constants derived from one step and two step estimation

    Seeds were assumed to have an initial viability of 99%

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