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ISSN : 1226-9999(Print)
ISSN : 2287-7851(Online)
Korean Journal of Environmental Biology Vol.35 No.4 pp.573-580
DOI : https://doi.org/10.11626/KJEB.2017.35.4.573

Toxicity Assessment of Phenanthrene using the Survival and Population Growth Rate of the Marine Rotifer, Brachionus plicatilis

Un-Ki Hwang, Hoon Choi, Soo-Jung Jang, Seung Heo, Ju-Wook Lee*
Marine Ecological Risk Assessment Center, West Sea Fisheries Research Institute, NIFS, Incheon 22383, Republic of Korea
Corresponding author : Ju-Wook Lee, 032-745-0684, 032-745-0686, leejuwook84@gmail.com
20171113 20171201 20171204

Abstract

The oxicity assesment of Phenanthrene (PHE) has been investigated by using the rate (r) of survival and population growth in rotifer Brachionus plicatilis. The survival rate was determined after 24 h of exposure to PHE. The survival rate of PHE had no effect at a maximum of 300 mg L-1. The r was determined after 72 h of exposure to PHE. It was observed that r in the controls (absence PHE) was greater than 0.5, but that it suddenly decreased with an increased concentration of PHE. PHE reduced r in a dose-dependent manner and a significant reduction occurred at a concentration of greater than 37.5 mg L-1. The EC50 value of r in PHE exposure was 63.7 mg L-1. The no-observed-effect-concentration (NOEC) of r in PHE exposure was 18.8 mg L-1. The lowest-observed-effect-concentration (LOEC) of r in the PHE exposure was 37.5 mg L-1. From the results, the concentration of PHE (greater than 37.5 mg L-1) has a toxic effect on the r of B. plicatilis in natural ecosystems. These results (including NOEC, LOEC and EC50) might be useful for the Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) toxicity assessment in marine ecosystems.


해산로티퍼 (Brachionus plicatilis)의 생존 및 개체군 성장률을 이용한 Phenanthrene의 독성평가

황 운기, 최 훈, 장 수정, 허 승, 이 주욱*
국립수산과학원 서해수산연구소 해양생태위해평가센터

초록


    National Fisheries Research and Development Institute
    R2017031

    서 론

    다환방향족탄화수소류 (Polycyclic aromatic hydrocarbons; PAHs)는 두 개 이상의 벤젠고리를 가지고 있는 유기오염물질이며, 낮은 농도에서도 독성이 강한 대표적인 발암성 환경오염물질로 알려져 있다 (Shin and Kim 2003; Chiapusio et al. 2007). PAHs는 다양한 물질을 포함하지만 대표적으로 naphthalene, phenanthrene (PHE), fluoranthene, pyrene 등이 있으며, 대부분 독성이 높지만 특히 PHE는 동물과 사람에게 암을 일으키는 물질로 분류되어 있다 (Wu et al. 2013). PHE는 산업화와 유류유출 사고 등으로 인해 생성되는 오염물질로 화석연료를 사용하는 산업현장에서 고농도로 측정되는 것으로 알려져 있다 (Edward 1983). 또한 PHE는 강물에 의해 지속적으로 해양으로 유입이 되고 있으나, 용해도가 낮고 분해가 잘 되지 않아 토양에 잘 흡수되어 퇴적물 내 고농도 로 축적될 수 있다 (Wilson and Jones 1993; Chiapusio et al. 2007). PHE는 생물체 내에 축적되어 대사작용을 방해할 뿐 만 아니라, 먹이사슬을 따라 최상위 포식자인 인간에게까지 영향을 미칠 수 있어 전 세계적으로 문제가 되고 있다 (Wolf et al. 1999; Wu et al. 2007). PHE는 생물의 초기 발생단계 에서 독성을 나타내며 심낭 및 난황 부종, 심장 기능장애와 같은 기형을 나타내거나 DNA손상, 전사 조절 방해, 세포사 멸 및 암을 일으키는 것으로 알려져 있다 (Heintz et al. 2000; Lin 2005; Yu and Lin 2005; Incardona et al. 2006, 2009). Zhang (2013)은 PHE에 노출된 제브라피쉬 (Danio rerio)에 서 심장이 비정상적으로 확장 및 팽창되어 심실벽 두께가 감소하는 심장 기형을 관찰하였고, Hodson (2017)은 무지개 송어 (Oncorhynchus mykiss)와 송사리 (Oryzias latipes)에서 유생의 기형 및 DNA 손상이 나타나는 것을 보고하였다.

    PHE의 위해성을 평가하기 위하여 다양한 생물종이 이용 되어 왔으나, 사육 및 관리가 상대적으로 어려운 해양생물 을 이용한 독성 연구는 아직도 미비한 것으로 판단된다. 해 양은 육상으로부터 다양한 오염물질이 유입되는 곳이며, 빈 번하게 발생되는 유류사고 등에 의해 PHE 등과 같은 PAHs 에 쉽게 노출될 수 있어 생태학적 지위가 다양한 해양생물 을 이용하여 PHE의 독성평가가 이루어져야 할 것으로 판단 된다. 따라서 본 연구에서는 해양생태계 내에서 1차 소비자 로써, 다른 시험생물에 비해 사육 및 관리가 쉽고 생활사가 짧아 세대교번을 통한 생물영향을 평가할 수 있는 해산윤충 류 Brachionus plicatilis의 생존 및 개체군 성장률을 이용하 여 PHE의 독성평가를 실시하였다.

    재료 및 방 법

    1.시험생물

    일반적으로 Rotifer는 어류치어의 먹이생물로 폭넓게 활 용되어 상업적으로 중요한 생물이며 (Hwang et al. 2016), 먹 이가 충분한 25℃의 수온에서 약 10일 정도 생존한다 (Snell and King 1977). 신생 개체 (neonate)는 24시간 안에 성체로 성장하여 세대교번이 가능하고 (Yoshinaga et al. 2000) 무성 생식과 유성생식이 동시에 가능하며 먹이가 충분한 환경에 서 1마리의 female은 20~40개체의 neonate를 생산할 수 있 다 (Jassen et al. 1993). 이러한 빠른 세대교번 속도로 로티 퍼의 개체군 성장률은 독성평가를 위한 평가방법으로 사용 되어 왔다 (Preston et al. 2000). 시험생물 B. plicatilis는 서 해수산연구소 해양생태위해평가센터 항온실에서 3개월 이 상 계대배양하며 이용하였다. 배양액은 자연해수를 0.45 μm membrane filter로 여과한 후에 멸균하여 사용하였고, 먹이 생물로 Chlorella vulgaris를 하루에 한 번 공급하였다. 실험 당일 계대배양 중인 B. plicatilis에서 포란 중인 성체 (amitic female)를 분리하고 2시간 이내 부화된 neonate 중 운동성이 활발한 neonate를 선별하여 사용하였다 (Fig. 1).

    2.Phenanthrene 농도 조성

    시험에 사용된 Phenanthrene (Sigma-aldrich, USA)은 DMSO (Dimethylsulfoxide, Sigma-aldrich, USA)를 carrier solution으로 사용하여 100,000 mg L-1의 stock solution을 제 작한 뒤, 멸균된 자연해수로 희석하여 사용하였다. 시험용 액에 사용된 DMSO의 최대 농도는 0.3%로 B. plicatilis에 서 독성이 나타나지 않는 농도로 사용하였다 (Gallardo et al. 1997). 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 PHE의 농 도는 0, 10, 50, 100, 300 mg L-1로 조성하였고, 개체군 성장 률에 미치는 영향을 알아보기 위하여 농도를 0, 9.4, 18.8, 37.5, 75, 150 mg L-1로 조성하였다. 개체군 성장률 시험의 농도 구간은 사전 예비실험을 바탕으로 설정하였고 생존율 시험의 최고 농도는 개체군 성장률 대비 2배로 결정하였다.

    3.생존율

    생존율 시험은 24 well plate에 시험용액을 농도별로 1 mL 씩 6반복 실시하였다. 부화한지 2시간 이내의 B. plicatilis의 neonate를 well당 5개체씩 넣고 25±1.0℃에서 24시간 암배 양한 뒤, 현미경을 이용하여 생존한 개체수를 계수하고 생존 율을 계산하였다 (Table 1). B. plicatilis의 생존 여부는 개체 의 운동성 또는 섬모와 저작기의 활성 유·무에 따라 판단 하였고 (Fig. 2), 대조구의 생존율이 90% 이상일 경우 유의미 한 시험결과로 사용하였다.

    4.개체군 성장률

    개체군 성장률은 24 well plate에 시험용액을 농도별로 1 mL씩, 6반복 실시하였다. 먹이생물 C. vulgaris는 원심분리 하여 배양액을 제거한 뒤 각 실험구당 200만 cell mL-1를 공급하였다. B. plicatilis의 neonate를 well당 5개체씩 넣고 25±1.0℃에서 72시간 암배양한 뒤 (Jansen 1994), 3% 포르 말린으로 고정하고 현미경으로 모든 개체수를 계수하여 개 체군 성장률을 계산하였다 (Table 1). 개체군 성장률은 아래 와 같은 계산식으로 도출하였고 대조구의 개체군 성장률이 0.5 이상일 경우에 유의미한 시험결과로 사용하였다.(1)

    P G R = ln N d ln N 0 d
    (1)

    PGR=개체군 성장률, Nd=날짜 d에서의 개체수, N0=초기 개체수, d=배양일

    5.통계분석

    대조군과 실험군의 유의성 검정은 SigmaPlot software (SigmaPlot 2001, SPSS Inc., USA)의 Student’s t-test로 비교 하였으며 p가 0.05 이하인 것을 유의한 것으로 판단하였다. 생존율 및 개체군 성장률에 대한 반수영향농도 (50% Effective Concentration; EC50)와 95% 신뢰구간 (95% Confidence Limit; 95% Cl)은 Toxicalc 프로그램 (Toxicalc 5.0, Tidepool scientific software, USA)의 probit 통계법을 이용하여 분석 하였다. 무영향농도 (No Observed Effective Concentration; NOEC) 및 최소영향농도 (Lowest Observed Effective Concentration; LOEC)도 Toxicalc 프로그램의 Dunnett’s test를 이용하여 분석하였다.

    결 과

    1.생존율 변동

    Phenanthrene (PHE)에 24시간 노출된 B. plicatilis의 생 존율 변동은 Fig. 3에 나타내었고, 대조구의 생존율은 90% 이상으로 시험에 적합하였다. 생존율은 50 mg L-1 농도에서 93.3±11.6%로 소폭 감소하였으나 유의적인 차이를 나타내 지 않았으며, 최고 농도에서도 유의적인 변화를 관찰할 수 없었다 (Fig. 3).

    2.개체군 성장률 변동

    B. plicatilis의 개체군 성장률 변화를 Fig. 4에 나타냈으며, 대조구의 개체군 성장률은 0.5 이상으로 시험에 적합한 것 으로 판단되었다. PHE의 농도 변화에 따른 개체군 성장률은 18.80 mg L-1 이하의 농도에서는 대조구와 유의한 차이가 없 었지만, 37.50 mg L-1에서 0.42±0.04 (p<0.01)로 대조구 대 비 16.17% 유의적인 감소가 나타나기 시작했다. 75.0 mg L-1 에서 0.11±0.07 (p<0.01)로 대조구 대비 76.93% 급격히 감 소하였으며, 최고 농도 150 mg L-1에서는 개체군 성장이 나 타나지 않아 B. plicatilis의 개체군 성장률은 PHE의 농도 증 가에 따라 감소하는 경향을 나타냈다 (Fig. 4).

    3.생존 및 개체군 성장률을 이용한 독성평가

    생존율은 최고 농도 300 mg L-1에서 변동이 없었으나, 개 체군 성장률은 PHE의 농도가 증가할수록 감소하는 농도의 존적인 결과가 나타났으며, 농도 반응 관계식은 표준독성 반 응으로 알려진 Sigmoid 곡선을 나타냈다 (Fig. 5). PHE에 노 출된 B. plicatilis의 개체군 성장률의 EC50은 63.7 (48.4~ 84.5) mg L-1, NOEC는 18.8 mg L-1, LOEC는 37.5 mg L-1를 나타내었다.Table 2

    고 찰

    산업화와 화석연료의 사용으로 발생한 PAHs는 강물을 통 해 연안으로 유입되어 해양생태계를 오염시키고 있다. 특히 PHE는 연체동물, 갑각류, 조류 및 포유류와 같은 광범위한 생물에서 독성을 일으키는 환경오염물질이며, 조직, 유전, 면 역, 생식, 발달 및 행동학적 등 여러 수준에서 독성을 나타 내는 것으로 알려져 있다 (Alves et al. 2017). PHE는 제브라 피쉬 (Danio rerio)에서 심장기능 및 형태형성 방해, 턱 축소 및 신체 측만을 유발하며 (Incardona et al. 2004), 참다랑어 (Thunnus thynnus)와 황다랑어 (Thunnus albacares) 등의 다른 종류의 어류 배아에서도 심장 기형을 일으킨다 (Incardonma et al. 2014). 수생생물뿐만 아니라 Wu et al. (2007)은 PHE 에 노출된 육상생물 지렁이 (Eisenia fetida)에서 lysenin 관련 단백질과 lombricine kinase 등의 변화를 관찰하였고, Sasaki (1997)는 인간의 림프구에서 P450과 epocide hydrolase 유전 자를 발현하는 human B-lymphoblastoid cell lin과 MCL-5를 이용하여 유전자 수준에서 돌연변이를 보고하였다. PHE는 광범위한 생물에게 영향을 미치고 있기 때문에 다양한 생태 학적 지위의 해양생물을 이용한 PHE의 위해성을 평가하는 연구가 필요하다고 생각되며, 따라서 최근 우리나라에서 생 물영향 연구로 활발하게 사용되고 있는 B. plicatilis의 생존 및 개체군 성장률을 이용하여 PHE의 영향을 평가하였다.

    본 연구결과 PHE에 대한 B. plicatilis의 개체군 성장률은 PHE의 농도가 증가함에 따라 농도의존적인 감소 현상을 보 였지만, 생존율은 최고 농도 (300 mg L-1)에서도 모든 개체가 100% 생존하였다. 생존율 (24시간)과 개체군 성장률 (72시 간)의 민감도 차이는 이전 연구에서 B. plicatilis를 중금속에 노출하였을 때 개체군 성장률이 생존율에 비해 2~9배 이상 민감한 일반적인 결과로 설명할 수 있다 (Hwang et al. 2016; Lee et al. 2016). 또한 이러한 현상은 Brachionus koreaus 에서도 보고되었는데, Won et al. (2016)의 연구에 따르면 WAF (Water Accommodated Fractions)의 주요 구성 성분인 naphthalene, PHE, fluoranthene에 노출된 B. koreaus에서 치 사 효과는 없었으며, 노출 1일 이후부터 생식능력이 현저하 게 감소되어 개체군 성장률이 최대 40% 이상 감소되었다. 이와 같은 이유는 B. koreanus의 cytochrome P450 (CYP) 유 전자와 glutathione S-transferase 유전자가 강하게 영향을 받 아 생존은 하지만 생식력이 억제되어 개체군 성장률이 감소 한다고 설명하고 있다 (Won et al. 2016). 실제 멕시코만에서 기름 유출사고가 B. plicatilis의 생식을 억제하여 개체군 성 장률을 감소시킨 전례가 있으며, 지역 및 종별로 차이가 있 다고 보고되어 있다 (Roberto et al. 2013). 따라서 PHE의 독 성평가에 있어 B. plicatilis의 개체군 성장률을 이용하는 것 이 더 명확한 방법이라고 판단된다.

    PHE 역시 마찬가지로 다양한 독성 범위가 나타난다. 물 벼룩 (Daphnia magna) 유영저해율의 EC50은 342.1 μg L-1 (Zindler et al. 2016), 383 μg L-1 (Munoz and Tarazona 1993), 950 μg L-1 (Xie et al. 2006)로 나타났다. 발광박테리아 (Vibrio sp)의 EC50은 약 1 mg L-1 (Johnson and Long 1998), Photobacterium phosphoreum은 0.53 mg L-1로 나타났고 (McConkey et al. 1997), 좀개구리밥 (Lemna gibba)에서는 5 mg L-1 이상으로 보고되었다 (McConkey et al. 1997). PHE에 대한 송사리 (Oryzias latipes)와 무지개송어 (Oncorhynchus mykiss)의 EC50은 96, 180~320 μg L-1로 나타났다 (Turcotte et al. 2011). 현재까지 PHE의 EC50은 다양한 농도 범위에 서 탐지되었고 본 연구의 결과 값보다 높은 독성을 보였으 나 톡토기류 (Folsomia sp)의 LC50의 경우 41 mg kg-1 이상 (Sverdrup et al. 2002), 67.7 mg kg-1 (Tourinho et al. 2015) 이었고 갑각류 (Porcellionides pruinosus)에서 137 mg kg-1 으로 본 연구결과와 유사하거나 보다 낮은 독성을 나타내 는 경우도 있었다 (Tourinho et al. 2015). 또한 DellaGreca et al. (2001) 연구에 따르면 24개의 PHE 화합물에 노출하였을 때 미세조류 (Raphidocelis subcapitata) EC50의 범위는 1.2~ 168.9 μM, 물벼룩 (Daphnia pulex)은 0.6~42.8 μM, 로티퍼 (Brachionus calyciflorus)는 4.3~1,098 μM로 나타나 노출되 는 오염원과 시험생물 간의 차이가 나타났다. 따라서 적절한 생물종과 방법을 선택하여 적용해야 할 필요가 있다.

    최근 우리나라 해양환경에서 PAHs 오염을 평가하기 위 해 전국 117개 해안의 퇴적물을 분석한 결과 16가지 PAH 농도의 합계가 8.80~18,500 ng g-1 dry wt.이었고 (Yim et al. 2007), 울산 산업단지 주변의 25개 지역의 PAHs를 분석한 결과 65~12,000 ng g-1 dry wt.로 조사되었으며 (Kwon and Choi 2014), 미국 북부 도시 주변의 PHE 분석결과 평균 200,000 ng g-1 dry wt.로 오히려 항구 (965 ng g-1 dry wt.) 및 수로 (825 ng g-1 dry wt.)보다 최소 200배 높게 나타난 연구 결과도 있다 (Kim et al. 2008). 우리나라는 지리적 특성상 해 안지역에 다양한 대형 산업단지 및 양식장이 있고, 전체 인 구의 33% 이상이 해안 가까이 거주하고 있지만, 주로 심한 오염지역이나 항구 주변에서 환경 분석 및 평가가 이루지고 있다 (Kim et al. 2002). 따라서 해안 산업단지 및 연안지역 과 해안 대도시 주변에서도 PHE 조사가 필요하다고 판단되 며, B. plicatilis의 개체군 성장률은 연안지역의 PHE 오염평 가에 유용하게 적용할 수 있을 것으로 생각된다. 또한, PHE 에 노출된 B. plicatilis의 독성결과를 이용하여 무영향농도 (NOEC), 최소영향농도 (LOEC) 및 반수영향농도 (EC50)를 제 시하여 해양환경 평가를 위한 기준치 마련을 위한 기초자료 로 활용하고자 하였다.

    적 요

    해산로티퍼 (Brachionus plicatilis)의 생존율 및 개체군 성 장률을 사용하여 Phenanthrene (PHE)에 대한 독성평가를 수 행하였다. PHE에 24시간 노출한 생존율은 최고 농도 300 mg L-1에서 영향이 나타나지 않았다. PHE에 72시간 노출한 개체군 성장률은 37.5 mg L-1 농도에서 급격한 감소가 시작 되어 최고 농도 150.0 mg L-1에서 개체군 성장이 나타나지 않아, 농도의존적으로 감소하는 경향을 보였다. PHE에 노 출된 개체군 성장률의 EC50 값은 63.7 (48.4~84.5) mg L-1, PHE에 대한 개체군 성장률의 NOEC는 18.8 mg L-1, LOEC 는 37.5 mg L-1로 나타났다. 연구결과 PHE를 평가하는 데 있어 생존율보다 개체군 성장률이 적합하며 해양환경에서 PHE의 LOEC 이상의 농도는 B. plicatilis에게 독성영향을 미칠 수 있는 농도로 판단된다. 또한 NOEC와 EC50은 독성 을 평가하는 기준점으로 이용할 수 있으며, 차후 PAHs의 통 합적인 생물영향을 판단하기 위한 기초자료로 해양생태계 평가에 활용될 수 있을 것이다.

    사 사

    본 연구는 2017년도 국립수산과학원 경상과제 (R2017031) 연구비 지원으로 국립수산과학원 서해수산연구소 해양생태 위해평가센터에서 수행하였다

    Figure

    KJEB-35-573_F1.gif

    Shape of adult (A) with egg and neonate (B) less than 2 h of B. plicatilis.

    KJEB-35-573_F2.gif

    Cilia and trophi of B. plicatilis.

    KJEB-35-573_F3.gif

    Change of survival rates of B. plicatilis exposure to phenanthrene.

    KJEB-35-573_F4.gif

    Change of population growth rates of B. plicatilis exposure to phenanthrene. The vertical bars represent the S.D. of the mean for six times. *p<0.05 and **p<0.01 for control.

    KJEB-35-573_F5.gif

    Concentrations-response by phenanthrene treatment using population growth rates of B. plicatilis. Closed circles indicate the observed values, and black and blue lines indicate the estimated values and 95% confidence limit, respectively.

    Table

    Culture condition of B. plicatilis

    Toxicity evaluation using survival rates (SR) and population growth rates (PGR) in the B. plicatilis exposed to Phenanthrene.

    NOEC: No observed effective concentration, LOEC: Lowest observed effective concentration, EC50: 50% Effective concentration, 95% Cl: 95% Confidence limit., SR: Survival rates, PGR: Population growth rates.
    *No effect of survival rate by Phenanthrene in 300 mg L-1 limits.

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