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ISSN : 1226-9999(Print)
ISSN : 2287-7851(Online)
Environmental Biology Research Vol.35 No.4 pp.670-676
DOI : https://doi.org/10.11626/KJEB.2017.35.4.670

The Pathogenicity and Biochemical Characteristics of Vibrio harveyi Isolated from the Pacific Abalone, Haliotis discus hannai

Jin-Do Kim*, Myoung-Sug Kim1, Kyung-Mi Won1, Jeong-Wan Do1, Deok Chan Lee1, Sung Hee Jung1, Se Yoon Jin1, Nam-Sil Lee1, Miyoung Cho1
SSFRI, National Institute Fisheries Science, Yeosu 58780, Republic of Korea
1Pathology Division, National Institute Fisheries Science, Busan 46083, Republic of Korea
Corresponding author : Jin-Do Kim, 061-690-8986, 061-685-9073, jdk0123@korea.kr
20171206 20171213 20171214

Abstract

Recently, mass mortality of the young abalone Haliotis discus hannai has occurred in commercial seed production farms in Korea. The mortality rate was above 50% of the total cultured organisms in the farm, and the shell length of the moribund organisms was about 3cm. The mortal phenomenon was that the young abalones were weakly scattered on the bottom of the pond from the attachment matrix, or that they could not be moved back to their normal positions. The diseased farmed Pacific abalone had abdominal edema. From the edema in the moribund individuals, three bacterial strains were isolated and all the strains were identified as Vibrio harveyi. These strains were compared with thirty six strains isolated from the fish. The results was that the Vibrio harveyi from the fish were sorted into genogroup A or B; however, the three strains of the diseased farmed Pacific abalone were sorted into genogroup A and the new genogroup C. The identical mortality and pathological symptoms of the naturally infected organisms were reproduced by artificial infection with WA AG-1 and WA CS-5 strains. The LD50 of WA AG-1 and WA CS-5 were each 1.0×103 cfu animal-1 and 1.7×104 cfu animal-1.


양식 전복 (Haliotis discus hannai)으로부터 분리된 Vibrio harveyi의 생화학적 특 성 및 병원성

김 진도*, 김 명석1, 원 경미1, 도 정완1, 이 덕찬1, 정 승희1, 진 세윤1, 이 남실1, 조 미영1
국립수산과학원 남해수산연구소
1국립수산과학원 병리연구과

초록


    National Fisheries Research and Development Institute
    R2017064

    서 론

    최근 국내의 전복 양식 방법이 해상의 가두리에서 대량 생산하는 규모로 발전함에 따라 전복의 종묘생산업도 크게 성장하게 되었다. 전복의 양식기술은 개발 초기에는 단지 부 착성 규조류를 부착 기질에 대량 배양하여 이를 전복 유생 의 먹이로 사용하여 전복을 사육하였다. 이어서 유생이 어린 전복으로 어느 정도 성장하게 되면 서서히 먹이를 해조류로 전환하여 사육하여 양성용 종묘를 생산하였다. 그러나 최근 에 어린 전복을 위한 전용 배합 사료가 개발됨으로써 이전 의 부착 규조류에만 의존하던 방법에 비하면 종묘의 크기가 월등히 크고 많은 양의 종묘를 생산할 수 있게 되었다. 이렇 게 생산된 대부분의 전복 종묘는 해상의 가두리 양식장으로 이송하여 사육된다. 따라서 사전에 종묘의 품질 및 건강 상 태가 전복의 양식에서 중요한 인자이다. 그러나 대부분의 전 복 종묘 양식장에서는 사육 수조 내에 지나치게 많은 양의 유생을 사육함으로써, 수조 내에 사료찌꺼기 등 침전물이 증 가하여 수질이 악화되어 사육 중인 어린 전복이 세균 등의 병원체에 노출되기 쉽다. 특히 전염성 바이러스나 세균에 감 염될 경우, 그 사망률이 높아서 생산량이 급감할 수 있다.

    현재까지 전복에 대량 폐사를 일으킨다고 알려진 질병은 바이러스의 일종인 전복 herpes virus (AbHV)에 의한 감염, ricketsia에 속하는 Xenohalioticus californiensis에 의한 감 염 등이다. 이에 관하여 국외에서는 여러 보고가 있었으나 (Wang et al. 2004; Chang et al. 2005; Hooper et al. 2007), 국 내에서는 비 병증 예의 근육 변성에 관한 보고가 있을 뿐이 다 (Kim et al. 2014).

    Vibrio harveyi는 해수 중에 상재하는 Gram 음성 세균으로 발광성을 지니며, 해양생물에 조건적으로 감염되어 피해를 입힌다 (Austin and Zhang 2006). 특히 새우 종묘의 생산에 있어 치명적인 피해를 주는 것으로 알려져 있으며 (Prayitno and Latchford 1995; Robertson et al. 1998), 전복에 있어서 는 근육에 수포를 형성하는 특징적 증상을 나타내며 대량 폐사를 일으킨다는 국외의 보고가 있다 (Sewabe et al. 2007; Jiang et al. 2013).

    본 연구는 최근 국내의 육상 전복 종묘 양식장에서 매년 발생되는 어린 전복의 대량 폐사와 관련하여 조사를 실시하 여 그 원인을 구명하고자 하였다. 그 결과, 폐사가 일어난 양 식장 내의 어린 전복으로부터 폐사와 관련된 세균을 분리 하였으며, 분리된 균을 전복에 병원성이 있다고 알려진 V. harveyi로 동정하였다. 또한 어류로부터 분리된 V. harveyi 의 동정에 관한 다른 연구자들의 결과와 비교하였으며, 인위 감염 시험을 실시하여 반수 치사농도 및 그 병원성을 확인 함으로써 전복의 대량 폐사와 관련된 원인균을 V. harveyi로 구명하였다.

    재료 및 방 법

    1.원인균의 분리 및 염기서열 분석

    원인균의 분리를 위해 국내 육상 전복 양식장이 밀집되 어 있는 전남 지역의 폐사 현상이 일어났던 적이 있는 양식 장 10개소 (완도 4, 해남 2, 진도 4개소)를 대상으로 6월부터 10월까지 매월 1회, 조사를 실시하였다. 조사를 위한 시료는 양식장 내의 수조에서 복부 근육에 수포를 형성하는 특징을 나타내며 폐사되고 있는 전복을 10마리 이상 채취하여 매월 100마리 전후의 전복을 대상으로 조사를 실시하였다. 채취 된 시료는 살아있는 상태로 실험실로 옮겨져 원인균의 분리 에 사용되었다. 각 개체의 환부로부터 일회용 주사기로 검체 를 채취하여 TCBS 및 BHI 평판 배지에 접종한 후, 도말하 였다 (Fig. 1). 도말된 평판 배지는 25℃에서 48시간 배양하 였으며, 배양 후 배지 상의 집락 중 우점종을 선택하여 균 동 정시험을 실시하였다.

    동정시험은 분리한 균을 API kit 20E (Biomereiux사) 및 Vibrio 4종 동정용 kit (국립수산과학원)에 의한 시험에 의 해 V. harveyi로 간이 동정된 균을 국내의 전문업체 (Solgent, Korea)에 sequencing을 의뢰하여 동정하였다. 또한 다른 병 원체인 전복 Herpes virus 및 X. californiensis의 검출 여부도 병행하여 조사하였다.

    전복 Herpes virus의 검출 여부는 시료 10마리씩을 pool로 하여 치설과 근육조직의 일부를 떼어내어 마쇄한 후 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 PCR을 실시하여 병원체의 감 염 여부를 확인하였다. 진단용 primer는 OIE (Office International des Epizooties; 국제수역사무국)에서 지정한 것을 사 용하였다 (Table 1). X. californiensis에 대해서는 전복을 해 부하여 내장과 근육의 일부를 마쇄한 후, DNA를 추출하여 OIE에서 지정된 primer를 사용하여 PCR (Polymerase Chain Reaction)기법을 통해 감염 여부를 확인하였다 (Table 2).

    2.균주별 인위 감염 시험

    분리된 균의 병원성을 확인하기 위한 인위 감염 시험에 는 전복에서 분리되었으나 서로 다른 genogroup a에 속한 WD CS-5와 genogroup c에 속한 3개의 균주를 같은 group 으로 간주하여 그중 WD AG-1만을 사용하여 인위 감염 시 험을 실시하였다. 인위 감염 시험은 15 L 용량의 사각 유리 수조 (45.0×30.5×33.0 cm)에 해수를 채워 균의 농도별로 건강한 어린 전복을 각각 10마리씩 수용하여 Air만을 공급 하면서 매일 20%씩 환수를 하였다 (수온 25℃). 균의 인위 감염을 위해 WA AG-1과 WA CS-5 를 각각 BHI 평판 배지 에서 25℃, 48시간 배양한 균을 Disposable Loop (Becton, Dickinson and Company)를 사용하여 집균하였다. 이를 생 리식염수로 1 mg mL-1의 농도로 희석한 것을 원액으로 하였 다. 이 원액을 희석하여 각각 1.15×102~105 cfu animal-1 및 1.10×102~105 cfu animal-1의 4단계의 농도별로 전복 10마 리의 발 근육 내에 0.05 mL씩 주사하였다. 또한 시험구당 1개 의 대조구를 설정하여 생리식염수를 0.05 mL씩 주사하였다.

    감염을 시킨 후에는 매일 시험 전복의 폐사 상황 및 수포 의 형성 등을 12일간 관찰하면서 기록하여 probit analysis에 의해 반수 치사농도를 구하였다 (Miller and Tainter 1944Miller and Tainter 1944). 또 한 폐사 직전의 어린 전복의 혈 림프액 및 수포로부터 균을 다시 분리하여 PCR에 의한 동정을 실시하였다.

    3.병리조직학적 변화

    인위 감염시킨 어린 전복의 병리조직학적 변화를 관찰하 기 위하여 균별로 가장 높은 농도로 주사한 시험구 (각 10마 리)를 별도로 설정하였다. 인위 감염 후에는 수온을 25℃로 유지하면서 2주간 병적인 증상의 발현 또는 폐사 직전의 어 린 전복을 선택하여 부검하여 조사하였다. 부검은 어린 전 복 전체를 부안액 (Bouin’s solution)에 고정한 다음, 12~24 시간 내에 패각으로부터 깨끗하게 분리하여 같은 고정액에 6시간 다시 고정한 후 Ethyl alcohol (60~100%)에서 단계 별 탈수, xylene에서 투명화 과정을 거쳐 파라핀에 포매하여 파라핀 조직 블록을 제작하고, Microtome (Leica, Germany) 을 사용하여 4 μm 두께로 박절하여 슬라이드글라스에 부착 시켰다. 이어서 50℃ 오븐에서 건조시켜 자동 자동염색시스 템 (Leica, Germany)으로 H&E (hematoxylin and Eosin) 염색 후, 봉입을 실시하여 제작된 조직표본을 광학현미경으로 관 찰하였다 (Scope A1, Zaiss, Germany).

    결 과

    1.원인균의 분리, 동정 및 염기서열분석

    폐사가 발생한 시기는 9월 초순경으로 수온이 고수온에 서 서서히 하강하는 시기였다. 이때의 수온은 23.0℃ 전후이 었으며, 전복은 2~3 cm 크기로 성장하였다. 폐사가 진행 중 인 사육 수조 내에서 폐사 직전의 전복을 10마리 이상을 수 거하여 원인균의 분리에 사용하였다. 이러한 개체들은 대부 분이 복부의 근육에 수포가 형성된 환부를 가지고 있었으며 (Fig. 1), 이들 환부로부터 균을 분리하여 동정한 결과, 전복 에 병원성이 있다고 알려진 V. harveyi로 동정되었다. 반면, 전복의 대량 폐사를 일으킨다고 알려진 전복 herpes virus 및 X. californiensis는 검출되지 않았다.

    분리된 4개의 균과 표준 균주 2개의 생화학적 특성을 비 교하여 시험한 결과, 본 균들과 표준 균주와의 생화학적 특 성의 차이는 TCBS 평판 배지 상에서의 colony의 색의 차이 외에는 모든 성상이 일치하였다 (Table 3). 또한 4개의 균과 현재까지 어류 및 전복 등으로부터 분리되어 V. harveyi로 보 고된 다른 균들과 염기서열을 비교하여 분석한 결과, 본 시 험에서의 4개의 균 중 1개는 genogroup a에, 또 다른 3개의 균은 genogroup c에 속하였다 (Fig. 2).

    2.균주별 인위 감염 시험

    인위 감염된 어린 전복은 감염 후 시간이 경과함에 따라 무기력해지면서 스스로 뒤집는 능력이 떨어지거나 복부의 근육 부분에 수포를 형성하는 특이한 증상을 나타내었다. WD AG-1과 WD CS-5 균주로 인위 감염시킨 전복의 폐사 는 균의 농도가 높은, 105 cfu animal-1의 농도의 시험구에서 감염 후 2일째부터 각각 4마리 및 1마리씩 폐사되었다. 이후 104 cfu animal-1의 농도에서는 5일째 50%가 폐사되었다. 이 를 profit analysis에 의해 균의 반수 치사농도를 산출한 결과, WA AG-1과 WA CS-5의 반수 치사농도는 각각 1.0×103 cfu animal-1 및 1.7×104 cfu animal-1이었다 (Fig. 3).

    3.병리조직학적 변화

    인위 감염시킨 어린 전복의 병리조직학적 변화는 세균감 염으로 인한 염증반응으로 보이는 혈구세포의 침윤이 각 조 직 부위에서 관찰되었다. 아가미는 상피세포의 비대 및 핵 응축으로 관찰되는 세포 변성과 함께 중심부에 혈구세포의 침윤이 관찰되었다 (Fig. 4a). 소화선 (digestive gland) 주위의 결합조직에서도 혈구의 침윤 반응이 관찰되었으며 (Fig. 4b), 소화선 상피에서는 호산성 과립구가 다수 관찰되었으며 결 합조직에도 혈구 침윤이 관찰되었다 (Fig. 4c).

    고 찰

    양식 중인 어린 전복의 대량 폐사에 관한 연구 중 병원 성 세균에 의한 폐사에 관한 연구로서 참전복 및 오분자기 에 대량 폐사를 일으키는 병원체가 V. carchariae 또는 V. harveyi로 밝혀진 바 있다 (Nishimori et al. 1998; Sawabe et al. 2007). 이 균은 연안의 해수 중에 상재하는 균으로서 쉽 게 분리가 되지는 않으나, 일정한 조건이 형성되면 다양한 해양 생물에 감염되어 피해를 주는 것으로 알려져 있다. 특 히 갑각류인 새우에 있어서는 전 세계적으로 피해를 일으키 고 있다 (Muroga 2001; Austin and Zhang 2006).

    본 연구에서 세균 검출 여부를 위해 조사한 전복의 90% 이상의 개체로부터 세균이 분리되었으며, 그중 비브리오로 간이 동정된 균주가 V. harveyi로 동정이 확정되었으나, 조사 당시 양식장에서 전복의 폐사가 발생한 사실과 전복으로부 터 본 균이 쉽게 분리된 사실로 유추해 볼 때, 전복 대량 폐 사의 원인이 V. harveyi에 의한 것일 가능성이 높다.

    본 균은 단독으로 전복에 감염되어 피해를 일으키는 경 우는 적지만 일단 발병하면 50% 이상의 폐사를 일으킨 예 가 많다 (Nicolas et al. 2002; Sewabe et al. 2007; Jiang et al. 2013). 본 균은 주로 해수의 수온 상승기인 6월경 및 하강기 인 9월 중에 50% 이상의 대량 폐사를 일으킨다고 알려져 있 었으나 (현지 양식어민의 설명), 본 연구의 조사 기간 중에는 9월 중에만 대량 폐사 현상을 확인할 수 있었다. 시기에 따 른 V. harveyi에 의한 감염 양상을 밝혀내지는 못하였으나, 관찰 사실로 미루어 볼 때, 전복 양식 현장에서는 9월 중에 감염방지를 위해 각별히 노력해야 할 것으로 보인다.

    V. harveyi에 감염된 전복에서 초기에는 그 증상이 쉽게 관찰되지 않으나, 폐사가 일어나기 시작하면 피해량이 급격 히 증가한다. 특히 최근의 지구 온난화에 의한 해수 수온의 상승, 부적절한 사육관리로 인해 전복이 병원성 세균에 대한 저항성 부족이 발병의 요인으로 작용할 수 있을 것으로 생 각된다 (Kim et al. 2005; Marie et al. 2009).

    본 연구에서 분리된 균은 기존의 전복에서 분리되어 보고 된 V. harveyi와 거의 같은 생화학적 성상을 나타내었으며, 인위 감염에 의한 시험도 다른 연구자의 연구와 비슷한 결 과를 나타내었다 (Sewabe et al. 2007). 이는 어린 전복의 대 량 폐사가 세균 감염에 의해서 일어날 수 있다는 사실을 입 증하여 준다. 하지만 반수 치사농도가 어류나 새우류에 대 한 다른 연구자의 연구 결과에서는, 104~107 cfu animal-1 의 높은 농도임에 비해 본 연구에서는 103~104 cfu animal-1 로 낮은 결과를 나타내었으므로 이에 대한 추가적인 연구 가 필요할 것으로 판단된다 (Alvarez et al. 1998; Soffientino et al. 1999). 조사 대상 양식장의 폐사를 일으킬 만한 환경 적 변화가 전혀 없었으며, 대량 폐사를 일으키는 병원체인 전복 herpes virus 및 X. californiensis의 검출이 되지 않았다 (Sewabe et al. 2007). 다른 세균성 질병과 마찬가지로 본 균 의 감염은 사육 환경의 악화에 많은 영향을 받을 것으로 생 각된다 (Judith et al. 2005; Youhei et al. 2010). 연어류의 감 염 예에서, 본 균의 독성이 Extracellular products (ECP) 내 에 있는 Hemolysin의 activity에 영향을 받는다고 보고한 바 있으므로 전복에 관한 연구에서도 이러한 요인 등의 작용 에 관한 연구가 수행되어야 할 것으로 생각된다 (Zhang and Austin 2000).

    본 연구에서 분리된 4개의 균주 중 3개 균주의 염기서열 은 어류에서 분리된 균과는 다른 genogroup에 속하는 것 으로 나타났으며, 이들 균주 내에는 전복 특유의 병원성 유 전 인자가 존재할 것으로 추정되어 앞으로 이에 관한 연구 도 필요할 것으로 생각된다 (Sewabe et al. 2007; Jiang et al. 2013). 또한 본 균만을 감염 초기에 신속하게 검출하기 위 한 특이 진단 키트의 개발도 요구된다 (Fukui and Sewabe 2007).

    병리조직학적으로는 궤양이나 출혈성 반점 등을 형성하 는 다른 비브리오 속 세균에 의한 감염 증상과는 달리 복부 의 근육 내에 수포를 형성하는 특징을 나타냈다. 세균 감염 에 의해 나타나는 염증 반응은 인위 감염된 전복의 각 주요 조직에서 나타났으며 특히 소화관 내에서 심하였다. 이는 본 균의 감염 메커니즘의 특성의 하나로 폐사에 관여할 것으로 생각되며, 전복 사육 수조의 청결성 유지, 먹이의 오염 방지, 오염되지 않은 사육수 확보 등 전복 양식 전반에 위생적인 면을 충분히 고려함으로써 본 균이 전복에 경구적으로 감염 되는 것을 적극적으로 방지해야 할 것으로 판단된다.

    적 요

    최근 어린 전복의 대량 폐사가 국내의 전복 종묘 양식장 에서 발생하였다. 죽은 어린 전복의 마리 수는 전체 사육 마 리 수의 약 50% 이상이었으며, 그 크기는 각장 3 cm 전후였 다. 폐사의 현상은 어린 전복이 부착 기질로부터 탈락되어 힘이 없이 바닥에 깔려 있거나, 뒤집어진 상태에서 스스로 일어나지 못하였다. 이러한 개체들은 대부분 근육에 수포를 형성하고 있는 병리학적 특징을 나타내었다. 폐사 직전의 전 복으로부터 3개의 균이 분리되었으며, 이들은 16S rDNA 염 기서열 분석에 의해 모두 V. harveyi로 동정되었다. 또한 이 들을 어류에서 분리된 V. harveyi 36개의 균들과 염기서열을 비교 분석한 결과, 어류에서 분리된 V. harveyi는 genogroup a와 b로 구별되며, 전복에서 분리된 3균주는 genogroup a 와 새로운 genogroup c에 속하였다. 그중 WA AG-1과 WA CS-5 균을 건강한 전복에 인위 감염시킨 결과, 자연 감염된 개체와 같은 외부 및 병리조직학적 증상을 나타내면서 폐사 하였으며, 그 반수 치사농도는 각각 1.0×103 cfu animal-1 및 1.7×104 cfu animal-1이었다.

    사 사

    이 논문은 2017년 국립수산과학원 수산생물질병 특성연 구 (R2017064)의 지원으로 수행된 연구입니다.

    Figure

    KJEB-35-670_F1.gif

    The characteristic symptoms as a blister (arrow) on the ventral muscle of diseased young abalone, Haliotis discus hannai.

    KJEB-35-670_F2.gif

    The diagram of genogroups between strains from the abalone and reference strains from the diseased various marine fishes. The represented strains in the red quadrangles are isolated V. harveyi of the present study.

    KJEB-35-670_F3.gif

    The mortality of abalone after artificial infection with two strains (a: WD AG-1, b: WD CS-5) of V. harveyi for 12 days.

    KJEB-35-670_F4.gif

    The histopathological changes in the major organs of artificial infected abalone, Haliotis discus hannai (a: Inflammatory epithelial cell (black circle), b: Epithelial ulceration and hemocyte infiltration in DG, c: Infiltration of eosinophilicgranular cell in DG (black arrow)).

    Table

    The primer sets for the detection of pathogenic herpesvirus in the abalone

    The primer sets for the detection of the pathogenic Xenohaliotis californiensis in the abalone

    The biochemical characteristic of four isolated strains from abalone, Haliotis discus hannai in comparison with reference strain of Vibrio carchariae (ATCC 35084) and Vibrio harveyi (ATCC 14126)

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