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ISSN : 1226-9999(Print)
ISSN : 2287-7851(Online)
Korean Journal of Environmental Biology Vol.35 No.4 pp.706-714
DOI : https://doi.org/10.11626/KJEB.2017.35.4.706

The Effects of Lead (II) Nitrate on the Embryo Development in Native Amphibians

Hae-Bum Lee, Sun-Kun Ko1,*
Graduate School of Biological Sciences and Biotechnology, Chonnam University, Gwangju 61186, Republic of Korea
1Department of Physical Therapy, Honam University, Gwangju 62099, Republic of Korea
Corresponding author : Sun-Kun Ko, 062-940-5432, 062-940-5207, sunkun@honam.ac.kr
20170921 20171214 20171214

Abstract

An investigation of the effects of Pb for domestic anuran embryos were evaluated with the Frog Embryo Teratogenesis Assay; Xenopus (FETAX). Depending on the species, the difference between the embryo size and the embryonic development time was determined. As a result, mortality and malformation rates were increased, malformation patterns were changed and larval body length were decreased in a dose dependent manner of the Pb. The half maximal lethal concentration (LC50) of the Bufo gargarizans, Hyla japonica, Rana nigromaculata and Bombina orientalis were 0.58, 0.49, 0.52, 0.54 mg L-1, respectively. The half maximal effective concentration (EC50) of the Bufo gargarizans, Hyla japonica, Rana nigromaculata and Bombina orientalis were 0.35, 0.74, 0.30, 0.29 mg L-1, respectively. The teratogenic index (TI) were 1.66 in the Bufo gargarizans, 1.81 in the Hyla japonica, 1.73 in the Rana nigromaculata and 1.86 in the Bombina orientalis, respectively. Therefore, the Pb seems likely to have a teratogenic effect in all four species’ embryonic development. The Bombina orientalis was the most sensitive to the Pb. This means that the difference between the different species, even if they have all been exposed to the same concentration of pollutants depending on the species. The result above show that the Pb acts as a teratogenic agent in the development of the four domestic frog species.


질산납이 한 국산 무미양서류의 배아발달에 미치는 영향

이 해범, 고 선근1,*
전남대학교 대학원 생 물과학·생명기술학과
1호남대학교 물리치료학과

초록


    서 론

    유해화학물질 중 중금속의 경우 자동차의 운행이 많은 도로나 교량 등에 축적되어 있던 것들과 폐광산의 광산 폐 석 등에 포함된 중금속이 강우 시 유출수에 포함되어 토 양 및 수계, 농경지 등으로 유입되어 생태계를 오염시킨다 (Nobotny et al. 1994; Kim and Lee 2005; Kim et al. 2005; Lee et al. 2006). 다량의 납에 노출될 경우 인간에서 빈혈, 소화기 장애, 신장 장애, 정자형성 기능 저해 등이 유발되는 것으로 알려져 있으며 (Karmarker et al. 1986; Fonia et al. 1995), 양서류에서는 배아의 발생 이상 및 아기미 기형, 척추 기형, 꼬리기형, 신경관 이상 등이 유발되는 것으로 알려져 있다 (Perez-Coll et al. 1988; Perez-Coll and Herkovits 1990; Sobotka and Rahwan 1995).

    FETAX (Frog embryo Teratogenesis Assay- Xenopus)는 기관형성이 활발하게 진행되는 단계의 양서류 배아를 이용 해 특정 화학물질의 척추동물에 대한 최기형성을 평가하 는 표준시험법이며 (Dumont et al. 1983), 1991년 American Society for Testing and Materials (ASTM)에서 최기형성평가 표준시험법으로 승인되어 (ASTM 1998) 이후 FETAX 방법 을 활용한 연구가 활발하게 진행되고 있다 (Carr et al. 2003; Vrskova and Modra 2012).

    본 연구에서는 국내에 서식 중인 개구리류 중 번식시기 와 주요 서식지가 서로 다르나 산란 시 농경지를 이용하 는 대표적인 국내산 무미양서류인 청개구리과 (Hylidae) 청 개구리 (Hyla japonica), 개구리과 (Ranidae) 참개구리 (Rana nigromaculata), 무당개구리과 (Bombinatoridae) 무당개구 리 (Bombina orientalis), 두꺼비과 (Bufonidae)의 두꺼비 (Bufo gargarizans) 배아들을 배양하면서 FETAX 방법을 응 용하여 Pb의 농도에 의한 사망률, 기형률, 기형 양상, 성장 률 등에 미치는 영향을 조사하고 이에 따라 반수치사농도 (half maximal lethal concentration; LC50)와 반수영향농도 (half maximal effective concentration; EC50), 기형성 지수 (tetatogenic index; TI) 등을 산출하여 Pb가 국내에 서식 중 인 개구리류의 배아발달에 미치는 영향을 파악하고자 한다.

    재료 및 방 법

    1.실험동물과 배아 준비

    실험에 사용한 두꺼비 (B. gargarizans), 청개구리 (H. japonica), 참개구리 (R. nigromaculata), 무당개구리 (B. orientalis)는 광주광역시 일대에서 포접 중인 개체들을 직접 채집하여 사용했다. 실험에 사용된 배아는 실험실에서 자연 배란에 따른 수정된 배아들 중 세포질이 균일하게 나뉘어진 배아만을 선택하여 포셉으로 젤리층을 제거한 후 낭배기까 지 배양하여 실험에 사용하였다.

    배아를 세척하거나 배양할 때는 6.6 g L-1 NaCl, 0.15 g L-1 KCl, 0.15 g L-1 CaCl2, 0.2 g L-1 NaHCO3, 0.05 g L-1 Streptomycin, 0.03 g L-1 Penicillin G를 혼합하여 Amphibian Ringer (AR) 용액을 제조한 후 pH를 7.4로 맞추어 사용하였 다 (Johnson and Volpe 1973).

    2.시험물질 처리

    Pb는 1,000 mg L-1 Lead standard solution (Pb(NO3)2 in HNO3 0.5 mol L-1) (MERCK, Germany)을 AR용액에 희석하 여 사용하였다. Pb의 효과농도를 조사하기 위해 Pretest (농 도 0.001, 0.01, 0.1, 1, 5, 10 mg L-1, 데이터 표시하지 않음) 를 통해 얻어진 결과 중 기형 및 치사가 나타나지 않은 0.01 mg L-1부터 모든 배아가 치사된 5 mg L-1까지의 농도를 대 상으로 보다 정확한 결과를 위해 더욱 세부적으로 분할하여 0.01, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2.5, 5 mg L-1 의 농도 구간을 설정하였다. 시험물질이 첨가되지 않은 배양 액에 대조군과 시험물질이 농도별로 포함된 실험군을 각각 종의 번식기 실외온도에 맞춰 배양하였으며, 외부의 영향을 최소화하기 위해 독립된 공간에서 노출배양하였다. 각각의 실험군은 10개의 배아를 배양하면서 24시간마다 새로운 배 양액과 시험물질로 교환하여 96시간 동안 배양하였으며 모 든 시험은 3회 반복하였다.

    3.결과 분석

    1)정상발생과정 조사

    유리 배양접시에 세포질이 균일하게 나뉘어진 30개의 배 아를 포셉으로 젤리층을 제거한 후 시험물질이 첨가되지 않 은 배양액에 배양하면서 매 24시간마다 새로운 배양액으로 교환하여 배양하면서 Gosner (1960)의 방법에 따라 발생과 정을 조사하였다.

    2)사망률

    사망률은 대조군과 실험군을 24시간마다 확인하여 치사 한 배아를 제거한 뒤 노출 96시간 후 생존한 것만을 관찰하 였다. 죽은 개체는 운동성이 없거나 세포 붕괴가 일어난 배 아와 기관이 형성된 뒤에는 심장이 멈춘 것을 죽은 것으로 판정하였으며 한 농도의 사망률은 96시간 동안 노출된 배 아 중 죽은 배아 수를 노출한 배아의 수로 나누어 계산하였 다 (죽은 배아의 수/노출된 배아의 수×100). 시험 농도 구간 은 5개 이상으로 설정하여 Probit 분석법을 통해 반수치사농 도 (half maximal lethal concentration; LC50)를 구하였다 (Goh and Neff 2003).

    3)기형율

    대조군과 실험군의 배아 중 치사된 것을 제외하고 96시 간 배양 후 생존한 배아를 대상으로 머리, 척추, 복부, 꼬리 등에 일어난 기형을 각각 부위별로 조사하였다 (Bantle et al. 1998). 기형율은 96시간 동안 노출된 배아 중 살아서 영향 을 받은 개체를 정상 개체로 나누어 계산하였으며 (살아서 영향을 받은 배아/정상 생존 배아×100) 농도 구간을 5개 이 상으로 설정하여 Probit 분석법을 통해 반수영향농도 (half maximal effective concentration; EC50)를 구하였다 (Goh and Neff 2003).

    4)기형 양상

    기형의 종류는 정상 발생된 개체를 기준으로 하여 꼬리가 물결치는 모양을 나타내거나, 휘어지는 양상 및 짧아지는 등 의 양상을 관찰하여 꼬리기형 (Tail Abnormality)으로 판정하 였고 척추가 활처럼 휘어지거나 굽는 등의 경우는 척추기형 (Spine Abnormality)으로 판정하였다. 또한 복부가 돌출되어 있거나 내부 장기의 팽만 및 소화기관의 형태 등이 정상개체 와 차이를 보일 경우 복부기형 (Abdominal Abnormality)으로 판정하였으며 머리의 형태 및 안구와 구강의 발달이 정상개 체와 차이를 보이는 경우를 두부기형 (Head Abnormality)으 로 판정하였다. 또한 두 가지 이상의 다양한 기형이 나온 경 우 복합기형 (Propound Abnormality)으로 판정하였다 (Bantle et al. 1991).

    5)성장률

    배아의 발달과 성장에 미치는 영향을 알아보기 위해 시 험물질에 96시간을 노출시킨 배아를 AM-423x Dino-Eye와 Dinocapture 2.0 program (ANMO)을 사용하여 배아의 직경 및 유생의 체장을 측정한 후 SPSS 20.0 program을 사용하여 Independent t-test로 대조군과 실험군의 유의성을 분석하였 다.

    6)기형성 지수 (Teratogenic Index; TI)

    기형성 지수 (TI)는 Probit 분석법을 통해 구한 LC50를 EC50으로 나누어 (LC50/EC50) 그 값이 1.5 이상으로 나타나면 시험에 사용된 개구리의 배아 발달과정에 최기형성을 나타 내는 것으로 판정하였다 (ASTM 1998).

    결 과

    1.정상발생과정 조사

    두꺼비의 경우 시험에 사용했던 낭배기 (Gastrula)의 배아 는 수정 후 대략 33시간 이내에 나타나기 시작하였으며 기 관형성 (organogenesis) 단계에서는 그 크기가 다소 증가하여 2.0±0.4 mm를 나타냈으며 꼬리지느러미 순환시기 (Tailfin circulation)까지는 127시간이 소요됐다. 청개구리는 수정 후 18시간 정도가 지난 후 낭배기를 나타냈으며 꼬리지느러미 순환시기까지 발생이 진행되기까지 109시간 가량이 소요됐 다. 참개구리와 무당개구리의 경우 낭배기의 배아가 출현하 기까지 각각 35, 43시간 가량이 소요되었으며 꼬리지느러미 순환시기까지는 각각 126, 135시간 내에 출현하는 것으로 나타났다 (Fig. 1, Table 1).

    2.Pb의 농도에 따른 치사율 조사

    96시간 배양 후 0.075 mg L-1의 농도에서 무당개구리의 배아가 치사되기 시작하였으며 청개구리와 참개구리의 배아 는 0.25 mg L-1의 농도에서 각각 6.67%가 치사된 것으로 나 타났다. 두꺼비의 경우 0.5 mg L-1의 농도부터 치사된 개체 가 확인되었으며 청개구리, 참개구리, 무당개구리의 경우 각 각 63.3%, 43.3%, 33.3%의 비율로 배아의 치사가 나타났다. 0.75 mg L-1의 농도에서는 청개구리, 참개구리, 무당개구리 의 경우 100.0%, 두꺼비의 경우 93.3%의 비율로 배아가 치 사하였으며, 1 mg L-1의 농도에서는 모든 배아가 치사되었다 (Fig. 2).

    3.Pb 농도에 따른 기형율 조사

    기형율의 경우 두꺼비와 청개구리, 참개구리의 경우 0.05 mg L-1, 무당개구리는 0.025 mg L-1의 농도에서 기형이 관 찰되기 시작하였으며, 0.25 mg L-1의 농도에서는 각각 23.3, 35.7, 17.9, 21.4% 배아에서 기형이 관찰되었다. 청개구리, 참 개구리, 무당개구리의 경우 0.5 mg L-1의 농도에서 100.0% 의 비율로 기형이 관찰되었으며, 두꺼비는 0.75 mg L-1에서 모든 배아가 기형을 나타냈다 (Fig. 3)

    4.Pb 농도에 따른 기형 양상 조사

    두꺼비에서 나타난 기형 양상은 0.25 mg L-1에서는 척추 기형 (28.6%), 꼬리기형 (42.9%), 복부기형 (14.3%), 복합기형 (14.3%)이 나타났다. 청개구리의 경우 0.1 mg L-1에서는 복 부기형 (20.0%), 머리기형 (80.0%)이 나타났으며, 참개구리는 0.05 mg L-1에서는 꼬리기형 (50.0%), 머리기형 (25.0%), 복 합기형 (25.0%)이 나타났다. 무당개구리에서는 0.1 mg L-1에 서는 복부기형 (50.0%), 머리기형 (50.0%)이 나타났으며, 모 든 배아에서 기형이 관찰된 0.5, 0.75 mg L-1에서는 복합기형 (100.0%)이 나타났다 (Figs. 4, 5).

    5.Pb 농도에 따른 성장률 조사

    성장률 조사 측정에 사용된 대조군의 경우 30개체를 측정 하였으며, 실험군의 경우 치사된 개체를 제외하고 측정을 실 시하였다 (농도 (개체 수). 두꺼비: 0.01 (30), 0.025 (30), 0.05 (30), 0.075 (30), 0.1 (30), 0.25 (30), 0.5 (21), 0.75 (2), 청개구 리: 0.01 (30), 0.025 (30), 0.05 (30), 0.075 (30), 0.1 (30), 0.25 (28), 0.5 (11), 참개구리: 0.01 (30), 0.025 (30), 0.05 (30), 0.075 (30), 0.1 (30), 0.25 (28), 0.5 (17), 무당개구리: 0.01 (30), 0.025 (30), 0.05 (30), 0.075 (30), 0.1 (30), 0.25 (28), 0.5 (20)). 두꺼 비 대조군의 경우 체장이 11.3±0.7 mm, 청개구리 6.2±0.5 mm, 참개구리 6.7±0.3 mm, 무당개구리 11.5±1.0 mm로 나 타났으며, 0.25 mg L-1 이하의 농도에서는 대조군과 거의 차 이를 나타내지 않았으나 두꺼비의 경우 0.75 mg L-1 (5.3± 1.5 mm), 청개구리, 참개구리, 무당개구리의 경우 0.5 mg L-1 (4.2±0.6 mm, 2.7±1.0 mm, 7.5±0.8 mm)의 농도에서 차이 를 나타냈다. Independent t-test로 대조군과 실험군의 유의성 을 분석한 결과 청개구리, 참개구리, 무당개구리 3종에서는 모두 0.5 mg L-1의 농도에서 p<0.01의 결과를 나타내었으 며, 두꺼비의 경우 0.75 mg L-1의 농도에서 차이를 나타냈다 (Fig. 6).

    6.Pb에 의한 기형성 지수 조사

    두꺼비, 청개구리, 참개구리, 무당개구리 LC50은 각각 0.58, 0.49, 0.52, 0.54 mg L-1로 나타났다. EC50은 각각 0.35, 0.27, 0.30, 0.29 mg L-1로 나타났으며, 기형성 지수를 나타내는 TI 는 각각 1.66, 1.81, 1.73, 1.86을 나타내었다 (Table 2).

    고 찰

    본 연구를 통하여 두꺼비, 청개구리, 참개구리, 무당개구리 등 국내에 서식하는 무미양서류의 배아발달과정을 확인하고 배양방법을 확립할 수 있었으며 본 실험에 사용했던 개구리 류의 배아 발달과정은 R. pipiens (Johnson and Volpe 1973; Mathews 1986) 및 Xenopus laevis (Deuchar, 1972)와 유사한 경향을 내타냄을 알 수 있었다.

    두꺼비, 청개구리, 참개구리, 무당개구리의 배아를 아가미 순환 및 꼬리지느러미순환 단계까지 배양하면서 Pb의 효과 를 조사한 결과 Pb의 농도가 증가함에 따라 배아의 치사율 및 기형율이 증가하는 양상을 나타냈다. 기형 양상은 0.025 mg L-1와 0.05 mg L-1의 농도에서는 주로 머리기형, 척추기 형, 복부기형, 꼬리기형 등이 나타났으며 청개구리, 참개구 리, 무당개구리는 0.5 mg L-1의 농도에서 100%의 복합기형 이 나타났으며 두꺼비는 0.75 mg L-1의 농도에서 100.0%의 비율로 복합기형이 나타나 Pb의 농도가 증가함에 따라 복합 적인 기형 양상이 나타남을 알 수 있었다.

    한편, Pb의 농도에 따른 배아의 성장률을 조사한 결과 청 개구리, 참개구리, 무당개구리의 경우 5 mg L-1의 농도에서, 두꺼비의 경우 0.75 mg L-1농도 대조군에 비해 현저하게 성 장이 억제되어 나타났다. 이러한 현상들은 시험물질의 농도 가 증가함에 따라 기형의 비율이 증가하면서 유생의 성장에 영향을 미친 것으로 판단되며, 북방산개구리 (R. dybowskii) 의 배아를 납에 노출시켰을 때의 결과와 유사한 양상을 나 타냈다 (Park 2007). 또한, Pb(NO3)에 노출시킨 B. arenarum 의 배아의 경우 1.0 mg L-1 이상의 농도에서 모든 배아가 치 사하였으며 0.5 mg L-1의 농도에서는 생존한 모든 배아가 기형을 나타내어 100.0%의 기형율을 나타냈다. 또한 꼬리 기형, 수포형성기형, 척추기형, 체장 감소 등이 보고되었다 (Pérez-Coll et al. 1988, 1990). 또한 Pb가 북방산개구리 (R. dybowskii)의 초기발생에 미치는 영향을 보면 1 mg L-1 이상 의 농도에서는 난할의 정지현상이나 세포붕괴 현상이 나타 났고 0.1 mg L-1의 농도에서는 난할이 지연되었다 (Ko and Lee 1999). X. leavis의 올챙이에 노출한 결과 100 mg L-1의 농도에서는 24시간 후에 사망을 확인하였으며 50, 30, 10 mg L-1에 노출된 경우도 각각 48, 72, 96시간 만에 치사하기 시 작했다. 1 mg L-1에 노출된 X. leavis의 올챙이는 정상 대조군 과 비교하였을 때 크기가 더 작아지고 유영 시 정상적이지 않았으며, 적혈구의 양이 현저히 낮아지는 강력한 빈혈의 징 후를 보였다 (Mouchet et al. 2007). 이러한 결과는 본 실험과 치사농도 및 기형율, 기형 양상, 체장 감소 등이 유사한 경향 을 나타내는 것을 알 수 있었다. 또한, 본 실험을 통해 산출 된 기형성지수 (TI)가 모두 1.5 이상을 나타내어 Pb에 노출된 4종의 양서류 배아에 강력한 기형성물질 (Teratogen)으로 작 용하며 기형성을 나타내는 것으로 생각된다.

    이상의 결과들을 종합해 볼 때 한국산 4종의 무미양서류 배아들은 Pb의 농도가 증가함에 따라 치사률, 기형율, 기형 양상 및 성장률 등이 영향을 받아 비교적 낮은 농도에서 민 감하게 반응하는 최기형성물질임을 알 수 있었으며, 광산의 폐석 (287.4 μg g-1, 266.0 μg g-1, 1820.5 μg g-1 등, 평균 Shale 의 납 함량: 20 μg g-1) 및 도로 분진 (강우 시 Total Pb 평균 42.7~56.1 μg L-1) 등에 존재하는 중금속이 유출 및 강수 등 을 통해 양서류의 번식지 및 산란지에 유입되어 (Kim and Lee 2005; Kim et al. 2005; Lee et al. 2006) 무미양서류들에 게 노출될 경우 배아의 발달과 성장의 저해 및 개체수 감소 현상 등이 야기될 것으로 판단된다. 이러한 Pb의 구체적인 작용양상을 규명하기 위해서는 더 많은 조사와 연구가 필요 한 것으로 생각된다.

    적 요

    국내에 서식하는 대표적인 무미양서류 중 두꺼비 (Bufo gargarizans), 청개구리 (Hyla japonica), 참개구리 (Rana nigromaculata) 및 무당개구리 (Bombina orientalis)를 대상 으로 각 종의 배아 발달에 미치는 Pb의 효과를 FETAX를 활 용하여 분석한 결과 4종의 배아 모두 Pb의 농도가 증가함에 따라 사망률, 기형율이 증가하고 다양한 기형 양상이 나타났 으며 성장률은 감소하였다. 두꺼비, 청개구리, 참개구리, 무 당개구리의 반수치사농도 (half maximal lethal concentration; LC50)는 각각 0.58, 0.49, 0.52, 0.54 mg L-1를 나타내었고 반 수영향농도 (half maximal effective concentration; EC50)은 각각 0.35, 0.27, 0.30, 0.29 mg L-1을 나타냈다. 기형성지수 (teratogenic index; TI=LC50/EC50)는 두꺼비, 청개구리, 참 개구리 및 무당개구리에서 각각 1.66, 1.81, 1.73, 1.86로 나 타나 무당개구리가 가장 민감한 영향을 나타냈으며 다음으 로 청개구리, 참개구리, 두꺼비 순으로 나타났다. 이는 서로 다른 종이 같은 농도의 오염물질에 노출되었다 하더라도 종 에 따라 차이가 나타날 수 있음을 의미한다. 이상의 결과를 통해 Pb가 무미양서류 4종의 배아 발달에 기형성 물질로 작 용함을 알 수 있었다.

    Figure

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    Embryonic development of the Rana nigromaculata. A: fertilized, B: 4-cell, C: Blastula, D: Gastrula, E: Neural fold, F: Muscular response, G: Gill circulation, H: Tailfin circulation. Scale bars=1 mm.

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    Frequencies of mortality according to Pb treated concentrations. (A) H. japonica, (B) R. nigromaculata, (C) B. orientalis, (D) B. gargarizans. Bar height represents mortality, and error bars indicate the standard deviation.

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    Frequencies of malformation ratio according to the Pb treated concentration. (A) H. japonica, (B) R. nigromaculata, (C) B. orientalis, (D) B. gargarizans. Bar height represents a malformation ratio, and the error bars indicate the standard deviation.

    KJEB-35-706_F4.gif

    External morpology of B. gargarizans (A, middle: abdominal, lower: propound), H. japonica (B, middle: abdominal, lower: propound), R. nigromaculata (C, middle: spine, lower: propound), B. orientalis (D, middle: head, lower: propound) tadpoles exposure to Pb at the gastrula stage. Arrow indicate anomalies. Scale bars=1 mm (upper: control, middle and lower: malfomation).

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    Frequency of malformation patterns according to the Pb treated concentration. (A) H. japonica, (B) R. nigromaculata, (C) B. orientalis, (D) B. gargarizans. Bar height represents the malformation ratio, and the error bars indicate the standard deviation.

    KJEB-35-706_F6.gif

    Measured tadpole body length of exposure for each Pb level. H. japonica (A), R. nigromaculata (B), B. orientalis (C), B. gargarizans (D) embryos were cultured for 96 hours in a petri dish which contained 10 mL. Bar height represents the mean, and the error bars indicate the standard deviation. The asterisk indicates a significant difference (**p<0.01, independent sample t-test).

    Table

    The change of the embryonic development time and body length according to stage in native amphibians.

    1: fertilized, 4: 4-cell, 9: Blastula, 12: Gastrula, 14: Neural fold, 18: Muscular response, 20: Gill circulation, 22: Tailfin circulation, Bu: B. gargarizans, Hy: H. japonica, Ra: R. nigromaculata, Bo: B. orientalis.

    LC50, EC50 and TI value on each species (H. japonica, R. nigromaculata, B. orientalis and B. gargarizans) embryos exposed to Pb

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