서 론

1990년대 이후, 한국 연안에서 적조는 주로 와편모조 류 (dinoflagellate)에 의해 발생해 왔다. 와편모조류는 갑 판 (thecal plate)을 가지는 유각와편모조류 (armoured dinoflagellate)와 갑판을 가지지 않는 무각와편모조류 (unarmoured dinoflagellate)로 구분이 되는데, 최근에는 무 각와편모조류에 의한 적조가 빈번하게 발생하고 있다.

무각와편모조류인 Akashiwo sanguinea는 1922년 일본 의 Kozusa-ura Gokasho 만에서 채집된 시료를 통해 형태 적 특징이 처음으로 기록되었으며 (Hirasaka 1922), 이 종 을 원인으로 하는 적조는 한국을 포함하여 멕시코, 남아 메리카, 중국 등 여러 나라 연안에서 발생하고 있다 (Wu et al. 2001;Yu and Hao 2009;Hao et al. 2011). A. sanguinea 는 무독 종이지만 고밀도로 증식하게 될 경우, 비누화 작 용 (saponification)에 의해 해조류 사멸과 수산 생물을 폐 사 시킬 수 있는 것으로 알려져 있다 (Botes et al. 2003;Jessup et al. 2009). 그 예로, 일본의 경우 Ariake해에서 김 의 황백화 현상을 야기시키는 원인 종으로 추정되고 있다 (Matsubara et al. 2007). 하지만, 한국 연안에서 A. sanguinea 적조 발생을 원인으로 한 피해사례가 아직까지는 보고된 적이 없으나 A. sanguinea 적조는 남해안 전역에서 광범위 하게 발생하고 있기 때문에 잠재적 유해종이라고 할 수 있 다 (Lee et al. 2005).

적조 생물의 대발생 (HABs; Harmful Algal Blooms)은 수 온, 염분, 영양염, 종간 경쟁 등의 다양한 이화학적, 생물학 적 요인 등에 의해 영향을 받는다 (Doucette and Harrison 1990;Steidinger et al. 1998;Wong et al. 1998). 특히, 연안에 서는 수온과 염분 조건이 적조 발생과 소멸에 있어서 매우 중요한 역할을 하기 때문에, 연안에서의 수온 및 염분 변 화에 대한 적조 원인 종의 상관성 연구는 반드시 필요하다 (Juhl et al. 2000).

우리나라에서 A. sanguinea에 관한 연구는 종의 생태학 적 특성 규명 연구가 대부분이고, 종의 구체적인 형태 분 석 및 분자계통학적 분류를 바탕으로 한 생리적 특성 규명 연구는 미비하다. 특히, 국내에서 기록된 A. sanguinea의 형 태적 특징은 광학현미경을 통해 관찰된 기록이 전부이고, 무각와편모조류의 분류를 위한 상추구 (apical groove)의 형태는 보고 된 적이 없다. 또한, 최근에 발표된 Luo et al. (2017)의 연구결과에 따르면, A. sanguinea는 채집 해역의 기원을 바탕으로 4개의 ribotype으로 구분되기 때문에, 다 양한 해역에서 채집된 시료를 통한 분류학적 연구가 수행 될 필요가 있다.

따라서, 본 연구는 거제도 장목항에서 A. sanguinea 적조 발생 당시 확보된 배양주 (strain)를 이용하여, 이 종의 형 태적 특징 및 분자계통학적 분석을 수행하고, 성장에 영향 을 미치는 온도와 염분 조건을 파악하고자 하였다.

재료 및 방법

1. Akashiwo sanguinea 분리 및 배양주 확보

A. sanguinea의 배양주 확보를 위해, 2016년 11월 7일에 거제 장목항 (34°59ʹ39.1ʺN, 128°40ʹ28.8ʺE)에서 이 종의 적 조 발생 당시의 해수를 채집하였다 (Fig. 1). 채집한 시료는 광학현미경 하에서 Pasteur pipette을 이용하여 세포를 분 리하였고, 96-well plate (Eppendorf, Hamburg, Germany)에 f/2-si 배지를 첨가하여 접종한 후, 온도 20°C에서 배양하 였다.

확보된 세포는 광학현미경을 통해 세포 상태를 확인하 고, 6-well plate (Eppendorf, Hamburg, Germany)에 접종하 여 온도 20°C, 염분 30 psu 및 광량 100 μmol m^-2 s^-1에서 유 지 배양을 하였고, 한국해양과학기술원 해양시료도서관 에 위치한 해양식물플랑크톤 기탁등록보존기관에 LIMSPS- 2587, 2588, 2589, 2590, 2591로 등록하였다.

2. Akashiwo sanguinea 의 형태적 관찰

A. sanguinea의 형태적 특징은 광학현미경 (Primo Vert; Zeiss, Germany)과 주사전자현미경 ( JOEL Ltd, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였다. 주사전자현미경을 통한 세 포 관찰은 건강한 상태의 배양주를 최종농도 2%인 사산화 오스뮴 (osmium tetroxide; OsO₄)과 혼합하여 1시간 동안 고정한 후, 에탄올 시리즈 (10, 30, 50, 70, 90, 99, 99%)로 15 분씩 탈수하여 임계점건조법 (critical point drying method) 을 통해 건조 시켰다. 건조된 시료는 aluminum stub에 고 정하고 백금코팅 (platinum) 하여 관찰 및 촬영을 하였다.

3. Genomic DNA 추출, PCR 증폭 및 DNA 염기서열 분석

A. sanguinea의 유전학적 특성 파악을 위해 Large subunit ribosomal DNA (LSU rDNA) 구간 분석을 수행하였다. 분 석을 위해 대수성장단계의 배양주 1 mL을 1.5 mL tube 에 분주하였다. 이후 원심분리기로 농축 및 상등액 제거 를 하여 -20°C의 냉동실에 보관하였다. Genomic DNA 추 출을 위해 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, USA) 를 이용하였고, LSU rDNA 증폭은 forward primer: 25F1 (5ʹ-CCGCTGAATTTAAGCATAT-3ʹ), reverse primer: 25R1 (5ʹ-CTTGGTCCGTGTTTCAAGAC-3ʹ)를 사용하 였다 (Kogame et al. 1999;Yamaguchi and Horiguchi 2005). PCR 반응액의 경우, 5 μL 10X Ex Taq Buffer (Mg^2＋plus), 1.25 U Ex Taq polymerase (Takara, Japan), 1 μM primer 및 1 μL DNA을 주입하여 최종 50 μL가 되도록 하였고, PCR 수행은 Eppendorf Mastercycler ep gradient (Eppendorf ) 으로 pre-denature는 95°C에서 2분, denature는 95°C에 서 20초, annealing은 55°C에서 1분, elongation은 72°C에 서 1분, post-elongation은 72°C에서 5분간 실시하였다. 증폭 반응의 경우 30회 반복 시행한 후, PCR 산물을 1% agarose gel에 전개하고 Midori Green Advance (NIPPON Genetics, Co., Ltd., Tokyo, Japan)로 염색하여 UV하에서 DNA 밴드를 확인하였다. 정제된 PCR product clone들의 DNA sequencing은 QIAquick PCR purification kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 ABI PRISM^® 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems, USA)으로 수행하였다.

4. 분자계통학적 분석

확보된 A. sanguinea의 염기서열을 이용하여 종의 계 통학적 위치를 파악하였다. 염기서열 비교를 위해 계통 수에 사용된 염기서열 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information; www.ncbi.nlm.nih.gov)를 통해 수집하였고, 총 35개의 염기서열이 Mega v. 7.0.26프로그 램 (Kumar et al. 2016)으로 정렬 및 편집되었다. 확보된 배 양주의 LSU rDNA 분석을 통해 얻은 염기서열은 Genbank 에 Accession No. MK571205~9로 등록하였다. 그 결과, 총 길이 626 kb의 정렬된 염기서열 자료 (dataset)를 얻을 수 있었고 Prorocentrum micans (KT860563)과 P. rhathymum (HF565181)을 out group으로 하여 jModelTest version 2.1.4 프로그램으로 분석하였다 (Darriba et al. 2012). 계 통학적 분석은 TrN+ G모델 (A:C:G:T=0.2491: 0.2052: 0.3020: 0.2408; p-inv=0; gamma shape=0.8720)을 사용 하였다. 그리고 계통학적 유연관계 분석에서 베이즈 추론 (BI; Bayesian Inference)은 MrBayes 3.1.2를 사용하였고, 최 대유사분석 (ML; Maximun-likelihood analysis)은 RAxML 을 이용하였다 (Ronquist and Huelsenbeck 2003;Stamatakis 2014). 최대유사분석에서 계통수의 각 branch의 신뢰도는 1,000회의 bootstrap을 이용하였다. 분석이 완료된 이후에 는 분석결과를 바탕으로 하여 각 종 간의 계통유연관계를 밝히는 분자계통도를 작성하였고, 분자계통도의 확인은 Tree-View 4.5 프로그램으로 수행하였다.

5. 온도 및 염분 조건에 따른 성장 변화

A. sanguinea의 성장 변화를 파악하기 위해 온도 조건은 5, 10, 15, 20, 25, 30°C의 6단계, 염분 조건은 15, 20, 25, 30, 35 psu의 5단계를 조합한 30단계의 조건, 그리고 광량은 100 μmol m^-2 s^-1으로 하여 실험을 하였다.

대수성장기의 A. sanguinea를 f/2-si 배지 30 mL와 함께 배양튜브에 최종세포밀도가 약 1.0×10² cells mL^-1이 되도 록 접종하였다. 이후 세포밀도 변화를 관찰하기 위해 이 틀 간격으로 동일 시간에 형광광도계 (10-AU-Fluorometer, Turner Designs, USA)를 이용하여 in vivo chlorophyll 형광 값을 측정하였다. 세포밀도는 현미경을 통한 직접검경이 아닌 형광값과의 상관관계를 통해 구하였다 (Fig. 2). 성 장속도 (growth rate)는 대수성장을 보이는 기간 동안의 세포밀도를 이용하여 아래의 식에 대입하여 계산하였다 (Guillard 1973).

결과 및 고찰

1. Akashiwo sanguinea 의 형태적 특징

A. sanguinea의 세포는 단독으로 존재하며, 오각형이었다 (Fig. 3A, B). 세포의 길이는 54.7~86.5 μm, 폭은 31.5~62.2 μm 로 나타났고 (평균 길이: 70.3 μm, 평균 폭: 48.5 μm, n=50), 세포의 길이와 폭의 비는 1.39였다 (average: n=50). 세포 의 핵은 세포의 중심에 위치하거나 약간 상추 (epicone)에 치우쳐 위치하였다 (Fig. 3C, D). 엽록체는 황갈색으로 세 포 전체에 퍼져있었다 (Fig. 3A~D). 상추는 반구형이거나 원뿔형이었으며, 상추구 (apical groove)는 광학현미경 상에 서 보이지 않았다. 하추 (hypocone)는 종구가 등축까지 연 결되어 있었고, 2개의 열편 (lobe)으로 나뉘었다. 전자현미 경으로 관찰한 A. sanguinea의 세포는 sulcus의 경우 상추에 손가락처럼 생긴 부분 때문에 intercingulum region이 좁았 다 (Fig. 4A). 상추와 하추의 길이는 유사하였다 (Fig. 4B). 상추구는 알파벳 e 모양으로 관찰되었다 (Fig. 4C, D).

A. sanguinea의 형태는 ribotype에 따라 크기 차이는 있 을 수 있지만, 형태적 특성으로 구분되지 않는다 (Luo et al. 2017). 장목만에서 확보한 배양주는 Hirasaka (1922)에 의 해 서술된 국외배양주의 형태 특성과 Cho et al. (2008)에 의해 서술된 국내 배양주의 형태적 특성과 유사하였고, 크 기는 기존에 서술된 배양주들과 차이를 보이기도 했다. 따 라서, A. sanguinea는 배양주에 따라 세포의 길이에는 약간 의 변이가 관찰될 수 있지만, 형태적으로 큰 변이는 일으 키지 않는 것으로 판단된다.

2. Akashiwo sanguinea 의 계통 분류학적 특성

확보된 배양주 염기서열의 진화적 유연관계는 4개의 ribotype으로 구분되었다 (Fig. 5). 4개의 ribotype에서 본 배양주는 일본, 서아프리카, 중국, 뉴질랜드에서 기록된 분리주 (isolate)들과 함께 ribotype A에 속하였다. 그리고 ribotype B에는 싱가포르, 한국 (고성), 멕시코 등으로부터 기록된 분리주가 포함되어 있었으며, ribotype C에는 미국 해역의 분리주, ribotype D에는 지중해에서 기록된 분리주 만이 포함되어 있었다.

Luo et al. (2017)의 결과에 의하면, A. sanguinea 내에서 ribotype A는 전 세계적으로 분포하고 있고 분자계통 발생 의 기반이 되기 때문에, 다른 ribotype들은 ribotype A에서 파생되었을 수 있다. 국내에 보고된 A. sanguinea 배양주 중 에서 장목항에서 분리한 배양주는 모두 ribotype A에 속하 였고, 경남 고성의 해역에서 분리한 배양주는 ribotype B에 속하였다. 이 결과는 국내 연안에서 다양한 ribotype에 속 하는 A. sanguinea가 출현하고 있고, 해역에 따른 환경적 특 성이 ribotype을 결정할 가능성이 있다는 것을 나타낸다.

3. 온도와 염분 변화에 따른 Akashiwo sanguinea 의 성장 특성

온도와 염분의 변화에 따른 A. sanguinea의 세포밀도 변 화는 Fig. 6에 나타내었다. A. sanguinea는 5°C를 제외한 모 든 온도 범위에서 성장을 보였고, 염분은 30°C에서 성장 에 제한이 있었지만, 10~25°C의 온도 범위에서는 모든 염 분 범위에서 성장을 보였다. 최대세포밀도 (maximum cell density)는 온도 25°C, 염분 30 psu에서 1,372 cells mL^-1로 나타났다.

A. sanguinea의 성장에 영향을 주는 온도 및 염분 인자를 통해 구한 성장속도에 대한 contour plotting를 Fig. 7에 나 타내었다. 그 결과 최대성장속도 (maximum growth rate) 는 온도 20°C, 염분 20 psu 조건에서 0.50 day^-1로 나타났고, 최적성장조건 (optimum growth condition, 최대성장속도 의 80% 이내 구간)은 온도 15~20°C, 염분 17~23 psu 범위 였다.

A. sanguinea의 최대성장속도와 조건에 대한 본 연구결 과와 이전 연구결과의 비교 내용을 Table 1에 나타내었다. 거제도 장목항에서 확보한 배양주는 국내 다른 해역에서 분리된 배양주들과 최적온도 조건에서 차이를 보였는데, 자란만에서 분리한 배양주 (최대성장온도: 25°C)보다는 저온에서, 통영에서 분리한 배양주 (최대성장온도: 16°C) 보다는 고온에서 최대성장조건을 보였다 (Lee et al. 2005;Kwon and Oh 2014). 하지만, Baek and Joo (2012)가 장목 항에서 분리한 배양주가 나타내는 최대성장온도는 본 실 험결과와 일치하는 온도 20°C에서 최대성장속도를 보였 다. 최대성장속도는 국내배양주 중에서 장목항 배양주가 0.5~0.54 day^-1로 가장 높은 성장속도를 보였다. 국외배양 주와 비교하면, 일본의 Hakata 만에서 확보된 배양주는 본 배양주보다 고온의 환경에서 비교적 빠른 1.13 day^-1의 최 대성장속도를 보였고 (Matsubara et al. 2007), 중국 Sishili 만의 배양주는 본 배양주보다 고온의 환경에서 비교적 느 린 0.41 day^-1 의 최대성장속도를 보였다 (Chen et al. 2015).

A. sanguinea는 ribotype 차이에 따라 최적성장조건이 다 를 수 있다 (Luo et al. 2017). Luo et al. (2017)은 동중국해에 분리한 ribotype A와 B의 배양주로 온도구배에 따른 실험 을 하였다. 그 결과 ribotype B는 A에 비해 고온의 환경에 서 높은 성장을 보였고, 15°C 이하의 저온에서는 성장제한 을 보였다. 따라서 장목항 배양주와 다른 해역에서 분리한 배양주들 간의 성장조건에 차이를 보이는 것은 ribotype이 다르거나, 해역에 따라 나타나는 온도에 대한 적응이 다르 기 때문으로 판단된다. 이를 확인하기 위해서는 여러 배양 주를 통해 A. sanguinea의 성장조건 차이가 유전적 차이로 부터 오는 것인지, 해역에 따른 차이로 오는 것인지에 대 한 추가적 연구가 필요하다. 본 연구의 결과들을 종합하 면, 전 세계적으로 분포하는 A. sanguinea는 형태적으로 유 사하지만, 해역에 따라 유전학적으로 여러 계통으로 나뉘 었고, 이에 따라 성장조건 또한 다르게 나타나는 것으로 판단된다.

최근 5년 동안 A. sanguinea의 적조는 우리나라 연안에 서 봄과 가을철에 발생하며, 주로 남해안 연안지역에서 고밀도로 발생하였다 (Table 2). 적조 발생시 수온은 대체 적으로 15~20°C 내외로 나타나 (Table 2), 본 실험의 최적 성장온도조건과 일치하는 결과였다. 하지만, 염분의 경우 27.3~32.8 psu 범위 내에서 적조 발생이 보고되었기 때문 에, 본 실험의 최적염분 조건인 15~20 psu와 차이를 보였 다. 이는 우리나라 연안에서 A. sanguinea의 적조 발생은 염 분보다는 성장에 적합한 수온 아래 다양한 환경요인이 영 향을 미칠 수 있음을 나타낸다.

한편, A. sanguinea의 성장은 규조류 (diatom)의 성장과도 연관이 되어 있기 때문에 (Matsubara et al. 2008), A. sanguinea 적조 원인을 규명하기 위해서는 규조류와 A. sanguinea 간 의 경쟁과 상호작용에 대한 연구도 수행되어야 한다. 하지 만, 본 연구는 온도와 염분에 따른 성장조건만 고려했기 때문에, 정확한 A. sanguinea의 적조발생기작 파악을 위해 서는 추가적인 연구가 필요하다.

적 요

거제도 장목항에서 분리한 Akashiwo sanguinea의 형태 와 계통학적 특성을 명확히 하고, 여러 온도와 염분구배 에 따른 성장조건을 파악하고자 하였다. A. sanguinea의 세 포는 오각형이었고, 세포의 길이는 54.7~70.3 μm, 폭은 31.5~48.5 μm로 나타났다. 핵은 세포의 중심에 위치하였 고, 엽록체는 황갈색으로 세포 전체에 퍼져있었다. 상추구 는 알파벳 e 모양이었다. 계통분석 결과 장목항에서 분리 한 본 배양주는 ribotype A에 포함되었다. 온도 및 염분구 배에 따른 성장 실험은 5°C 이하의 온도를 제외한 모든 온 도구배에서 성장이 나타났다. 그리고, 최대성장속도는 온 도 20°C, 염분 20 psu에서 0.50 day^-1로 나타났고, 최대세포 밀도는 온도 25°C, 염분 30 psu에서 1,372 cells mL^-1였다. 이 결과는 A. sanguinea가 가을철에 한국 연안에서 최대 증식 을 보일 수 있다는 것을 나타낸다.