서 론

양식에서 일반적으로 사육수 내 발생하는 총 질소를 생 물학적으로 감소시키는 경로는 크게 두 가지로 암모니아 를 아질산, 질산으로 변환시키는 질화과정 (nitrification)과 질산을 질소가스로 전환시키는 탈질과정 (denitrification) 이 있다 (Spotte 1979). 사육과정에서 발생하는 암모니아, 아질산은 흰다리새우 (Litopenaeus vannamei)에게 독성으 로 작용하여 제거되지 않았을 경우는 스트레스와 대량폐 사를 일으키는 원인이 (Le Moullac and Haffner 2000;Tseng and chen 2004) 되기 때문에, 사육수 교환이나 질화과정 이 원활하게 이루어져 제거되어야 한다. 이러한 이유로 대 량의 사육수를 교환하여 질소원을 희석하는 유수식, 소 량의 사육수를 환수하면서 미생물 여과조에 의해 제거하 는 순환여과식, 식물 또는 해조류를 이용하여 질산을 제거 하는 아쿠아포닉스, 물을 교환하지 않고 다양한 미생물의 질산화과정을 이용하여 제거하는 바이오플락기술 (BFT; biofloc technology) 등 다양한 양식방법이 적용되고 있다.

이 중 바이오플락기술은 사육수 교환 없이 미생물의 질 화과정을 이용하여 양식에서 발생하는 독성 있는 암모니 아와 아질산을 제거하는데, 바이오플락을 이용한 흰다리 새우 양식은 미생물의 성장과 사육생물의 생육 수온을 고 려하여 동절기에도 25°C 이상 수온을 유지하기 위한 가온 이 필요하다. 또한 미생물이 증식하여 암모니아, 아질산 농 도가 안정되기까지는 약 2개월 이상의 시간이 소요된다. 총 양식기간 동안 (3~4개월간) 암모니아와 아질산을 산화 시키는 미생물들이 대량으로 증식한 (Burford et al. 2003) 바이오플락 사육수를 버리지 않고 일부를 소독한 물에 접 종하면 미생물 증식이 촉진되어 1개월 이내에 수질을 안 정화 할 수 있다. 그러나 아질산 산화 후 생성되는 질산은 일반적으로 새우에게 독성이 없다고 알려져 있었으나 고 농도로 축적 (>500 mg L^-1)된 질산은 흰다리새우의 성장 과 생존에 영향 (Kuhn et al. 2010;Furtado et al. 2015a)을 미 쳐 바이오플락 사육수를 재사용하기 위해서는 질산을 제 거하는 탈질과정 (denitrification)이 반드시 필요하다. 또한 바이오플락 사육수 내 미생물들의 질산화과정에서 질화 세균과 타가영양세균에 의해 알칼리와 pH를 소비, 그 값 이 지속적으로 감소하는데 (Ebeling et al. 2006) 이때 낮아 지는 pH를 유지하기 위하여 중탄산나트륨을 일정량 공급 하여 알칼리도를 150 mg L^-1 전후로 관리해야 한다. 그런 데 탈질과정을 거친 바이오플락 사육수는 pH, 알칼리도가 증가하여 (Samocha et al. 2017), 탈질이 된 바이오플락 사 육수를 재사용할 경우 소비되는 중탄산나트륨의 양을 줄 일 수 있어 경제적이며 활성화된 미생물을 이용하여 수질 안정화 기간을 단축할 수 있다. 이러한 장점에도 불구하고 탈질이 된 사육수가 양식생물에 미치는 영향에 대한 연구 는 미미한 실정이다 (Leungprasert and Chanakul 2010).

본 연구는 바이오플락 사육수 내 질산을 탈질과정을 통 해 제거하고 물리적으로 변화된 탈질사육수가 어린 흰다 리새우의 생존 및 생리적 특성에 미치는 영향을 파악하고 자 하였다.

재료 및 방법

1. 실험설계

탈질한 바이오플락 사육수가 어린 흰다리새우에게 미 치는 영향을 파악하기 위하여 국립수산과학원 서해수산 연구소 태안 양식연구센터에서 흰다리새우 양성 시 조성 된 바이오플락 사육수 1,000 L (암모늄 0.3 mg L^-1, 아질산 0.3 mg L^-1, 질산 165 mg L^-1)를 밀폐용기에 넣어 산소를 공 급하지 않고 탄소원으로 에탄올 500 mL를 넣어 혐기상태 로 만들고 질산 농도가 감소된 이후 1일간 산소를 공급하 여 실험에 활용하였다. 탈질한 사육수 수질은 암모늄 6.9 mgL^-1과 아질산 0.3 mg L^-1, 질산 9.2 mg L^-1로 생물사육에 적정한 수준이었으나 탈질 전보다 암모늄 농도가 다소 증 가하였다.

실험에 사용한 흰다리새우 유생 (PL₁₀기)은 바이오플락 사육수에서 52일 사육한 어린새우로 평균체중은 1.03± 0.26 g, 평균체장은 5.5±0.5 cm였다. 실험수조는 10 L 아크 릴 수조로 수조 당 20마리씩 입식하였으며, 각 실험구마다 3배구로 일반해수 (SW 대조구), 일반해수 (SW; seawater) 와 탈질수 (DNW; denitrified biofloc water)를 3:1로 혼합한 (SW:DNW=3:1) 실험구, 일반해수와 탈질수를 1:1로 혼 합한 (SW:DNW=1:1)실험구와 탈질수 (DNW)만 넣은 실 험구 총 3개의 실험구를 설정하였다. 실험 4일간 수행하였 으며 이후 전체시료를 수거하여 생존율을 파악하였으며 체액분석에 활용하였다.

2. 체액분석

체액분석은 각 실험구마다 9마리씩 무작위로 선택하 여 무게를 측정하고 한 마리씩 증류수 3 mL에 넣어 마쇄 한 후 원심분리 (8,000 rpm, 10분, 4°C)하여 상등액을 혈 액분석기 (Fuji Dri-Chem, 3500i, Japan)로 총 단백질 (total protein), 콜레스테롤 (cholesterol), 글루코즈 (glucose), 트리 글리세라이드 (triglyceride), 크레아틴 (creatine), 혈중 요소 성 질소 (BUN), 나트륨 (Na⁺), 칼륨 (K⁺), 염소 (Cl^-)를 측정 하였다. 실험구간의 시료 크기에 따른 오차를 줄이기 위하 여 측정된 시료의 무게로 각 분석값을 환산하였다. 즉 mg dL^-1와 mEq L^-1를 mg g^-1으로 환산하여 비교하였다.

3. 사육수 수질 및 이온분석

실험기간의 사육수 수질변화는 수온, 염분, 용존산소 (DO), pH는 수질측정기 (YSI EXO 2, Yellow Springs Instrument Co., Inc., USA) 로 매일 측정하였다. 암모니아, 아질 산은 표준 검정법에 의해 분광광도계 (spectrophotometer, Thermo co. Germany)를 사용하여 측정하였으며 질산은 해 양공정실험법의 카드뮴 관을 통과시켜 아질산으로 치환 후 측정하는 방법의 오차 및 실험과정을 신속히 수행하고 자 질산 농도를 0~150 mg L^-1로 설정하여 분석키트의 발 색 시약을 사용하여 표준검정선 (Fig. 1)을 만들고 분석키 트로 시료를 분석하여 분광광도계에서 흡광도를 측정하 였다. 알칼리도는 분석키트를 사용하였다. 사육수 이온변 화는 실험시작 1일째와 4일째 시료를 취하여 이온 크로마 토그래피 (ICS-1100, Thermo Fisher Sciences, Germany)를 이용하여 7가지 이온 (Na⁺, Cl^-, K⁺, Mg⁺⁺, Ca⁺⁺, SO₄^-, Br^-) 을 분석하여 이온변화를 조사하였다.

4. 통계처리

통계처리는 SPSS (Statistical Package for Social Science, version 13. software) 통계프로그램으로 실험구간의 일원 분산분석 (one-way ANOVA, Turkey’s honest test (p<0.05)) 에서 유의성검증을 실시하였다.

결과 및 고찰

1. 수질환경변화

바이오플락 탈질수 혼합비율에 따른 흰다리새우의 생 리적 변화를 조사하기 위하여 실험한 결과는 Fig. 2와 같 다. 암모늄 농도는 1일째 각 실험구마다 유의적인 차이를 보였다. 탈질수가 많이 혼합이 될수록 높은 값을 보였다 (SW 0.1 mg L^-1, SW:DNW (3:1) 2.1 mg L^-1, SW:DNW (1:1) 3.3 mg L^-1, DNW 6.9 mg L^-1). 그러나 시간이 경과할수록 탈 질수를 넣지 않은 실험구와 낮은 비율로 혼합한 실험구에 서 암모늄 농도가 급격히 증가하여 실험종료인 4일째에 는 모든 실험구에서 유의적인 차이를 보이지 않았다 (SW 11.61 mg L^-1, SW:DNW (3:1) 10.86 mg L^-1, SW:DNW (1:1) 11.03 mg L^-1, DNW 12.84 mg L^-1). 아질산의 경우 탈질수 (DNW) 실험구를 제외하고 유의적 차이를 보이지 않았으 나 탈질수 실험구에서는 실험 1일째 0.28 mg L^-1에서 4일 째 2.02 mg L^-1으로 7.2배 증가하였다. 질산은 실험 1일~3 일째까지 모든 실험구에서 탈질수를 많이 첨가할수록 평 균값은 높았으나 편차가 커서 실험구간의 차이를 보이지 않았으며 4일째는 탈질수 실험구에서 유의적 증가를 보였 다 (SW 2.51 mg L^-1 SW:DNW (3:1) 2.22 mg L^-1, SW:DNW (1:1) 6.10 mg L^-1, DNW 40.75 mg L^-1). 이는 탈질수가 바이 오플락을 처리한 사육수로서 자가세균, 타가세균 등 다양 한 미생물이 다량 포함되어 있어 탈질과정을 거친 후라도 암모니아와 아질산 산화세균이 존재하여 질화과정을 거 쳐 질산이 축적된 것으로 판단된다. 그 이유는 해수만을 넣은 SW 실험구에서는 암모늄의 증가속도가 가장 높았으 며 아질산으로 전환되는 비율이 가장 낮았고 질산의 비율 또한 4.9 mg L^-1로 유지되어 미생물에 의한 질화과정을 확 인할 수 없었지만 다른 실험구에서는 아질산으로 전환이 되는 것이 뚜렷이 나타나 탈질을 한 후에도 미생물이 존재 하는 것으로 나타났다.

실험기간 동안 실험구간 pH는 SW에서 7.75~7.90이었 으며 SW:DNW (3:1)에서는 8.08~8.15, SW:DNW (1:1) 는 8.20~8.25, DNW에서 8.42~8.41 범위로 나타났으며 실험기간 동안 통계학적으로 유의적인 차이를 보였으나 (p<0.05) 흰다리새우에게 영향을 미치지 않는 (7.0~8.4) 범위였다 (Leugprasert and Chanakul 2010). 알칼리도 또 한 pH와 같이 차이를 보였으며 SW에서 155.0~158.3 mg L^-1, SW:DNW (3:1) 248.3~261.7 mg L^-1, SW:DNW (1:1)는 345.0~356.7 mg L^-1, DNW 528.3~590.0 mg L^-1으로 탈질한 사육수에서 pH와 알칼리도가 일반해수에 비해 유의적으 로 높게 나타남에 따라 바이오플락 미생물에 의해 감소하 는 알칼리를 보완하는데 탈질 수가 도움이 될 것으로 사료 된다. 용존산소 (DO)의 경우는 실험구간별로 차이를 보이 지 않았고 6.3~6.61 mg L^-1의 적정 농도를 유지하였다.

2. 생존율

총 240마리 중 5마리가 폐사가 발생하였으나 3배구 실 험구 중 한 곳에서 1마리씩, SW:DNW (1:1) 실험구에 서 2마리 폐사가 관찰되어 해수와 바이오플락 탈질수 의 혼합비에 따른 생존율 간 유의한 차이를 보이지 않았 다. 최종 생존율은 각각 SW 98.3%, SW:DNW (3:1) 98.3%, SW:DNW (1:1) 96.7%, DNW 98.3%로 높은 생존율을 보 였다 (Fig. 3). 생존에 결정적인 영향을 주는 요소는 독성 을 나타내는 암모니아와 아질산으로 Lin and Chen (2001) 의 연구에 의하면 어린 흰다리새우를 암모늄에 96시간 노 출 시 반수치사 농도가 35 psu에서 NH₄-N 38.54 mg L^-1 로 본 연구에서는 최대 9 mg L^-1 (NH₄-N)로 안정적인 범 위였으며 5.6 cm 치하의 경우 아질산 또한 반수치사농도 가 321.7 mg L^-1로 조사되어 (Lin and Chen 2003) 모두 생 존에 영향을 미치지 않는 농도로 나타났다. 양식과정에 서 pH의 큰 변화는 독성으로 또는 스트레스 요인으로 갑 각류에 작용하기도 하여 생존율과 성장저해를 야기하기 도 하는데 pH가 너무 낮거나 높으면 체내 산과 염기의 평 형을 방해하고, 이온조절, 암모니아 배출 (Chen and Lee 1997;Wood 2001), Na-, K-ATPase 활성의 촉진 (Wang et al. 2002) 등으로 생리적 기능 이상과 면역력 감소로 인한 질 병감염과 대량 폐사가 일어나기도 한다 (Distefano et al. 1991;Chen and Chen 2003;Li and Chen 2008). Zhou et al. (2009)의 pH에 따른 6 g의 흰다리새우 스트레스 반응실 험 결과에서 pH 9에 12시간 노출 시 사망률이 100%이었 으나 본 실험에서는 pH가 최대 8.4로서 이에 따른 생존율 의 차이가 나타나지 않았다. 새우 양식에서 요구되는 적정 알칼리도는 100~150 mg L^-1 (Timmons and Ebeling 2013), 100~180 mg L^-1 (Samocha et al. 2017)으로 알려져 있다. 흰 다리새우 유생으로 50일간 바이오플락 양식조건에서 알 칼리 농도별 실험을 한 Furtado et al. (2015b)의 경우 0.2 g 의 어린 흰다리새우로 알칼리 농도에 따른 영향을 분석 한 결과 최대 300 mg L^-1의 알칼리도에서도 생존율의 차이 를 보이지 않았으며 성장률이 가장 높은 것으로 조사되었 다. 반면 알칼리도가 320 mg L^-1로 높은 사육수에서 보리 새우 (Marsupenaeus japonicus)를 75일간 사육한 경우 비교 구 (92%) 대비 실험구 (79%) 생존율이 감소되고 새우의 아 가미, 눈 등을 포함한 모든 부분에 미네랄이 침착되었다는 보고가 있으나 (Gopalakrishnan et al. 2011) 본 연구는 단기 간 생리변화를 관찰한 실험으로 미네랄의 축적이 관찰되 지 않았으며 생존율의 변화를 보이지 않았다.

3. 체액변화

어린 흰다리새우의 혈림프를 포함한 체액을 분석한 결 과는 Fig. 4와 같다. 총 단백질 (total protein)과 글루코스 (glucose)는 탈질수의 함량이 높은 곳에서 더 증가하는 것 으로 나타났다. 콜레스테롤 (cholesterol)은 SW에서 가장 높은 값을 보였고 탈질수를 섞을수록 그 평균값이 감소 하였다. 중성지방인 트리글리세라이드 (triglyceride)가 최 고 값을 보인 실험구는 SW:DNW (1:1)로 52.6±27.9 μg mg^-1, 가장 낮은 값을 보인 실험구는 DNW로 37.7±4.0 μg mg^-1였다. Racotta and Hernάndez-Herrera (2000) 연구결 과에 의하면 최대 2.14 mmol의 암모니아성 질소에 흰다 리새우 10 g을 노출 시 혈림프 변화를 보면 암모니아 농도 의 증가에 따라 총 단백질, 글루코스와 콜레스테롤이 증 가하다 암모니아 최대 농도인 2.14 mmol에서 감소하였으 며 유의적인 차이를 보이지 않은 것과 같이 본 연구에서도 동일한 변화양상을 보였고 새우 체액 성분인 총 단백질, 글루코스, 콜레스테롤이 실험구간별로 차이를 보이지 않 았다 (p<0.05). 그러나 조직손상의 지표이며 단백질대사 작용의 산물로 생리적 기능의 지표로 작용하는 크레아틴 (creatine)과 혈중 요소성 질소 (BUN)는 DNW 실험구에서 유의적으로 증가하는 것으로 나타나 탈질수가 어린새우 의 생리적 영향이 있음을 알 수 있었다 (p<0.05). 체액 내 이온변화를 보면 Na⁺, K⁺ 이온 모두 탈질수를 첨가한 비 율이 높아질수록 체액 내 이온이 유의적으로 감소하는 것 으로 나타났으며 특히 Cl^- 이온의 경우는 SW:DNW (3:1) 실험구와 DNW 실험구 유의적 차이를 보였다 (p<0.05). 이러한 결과는 보리새우에서 암모니아, 아질산 스트레스 를 검사한 Cheng et al. (2013)의 암모니아 (0.33 mmol L^-1, 7.0 mg L^-1)와 아질산 (0.33 mmol L^-1, 15.2 mg L^-1)에 노출 시 체내 Na⁺, K⁺, Cl^- 이온의 농도가 감소한다는 연구결과 와 같이 본 연구에서도 생존에 영향을 미치지는 않았지만 SW:DNW (1:1)과 DNW 실험구 간 체내 이온이 유의적으 로 감소를 하여 스트레스 요인으로 작용 되었을 것이라 사 료된다.

4. 사육수 이온변화

탈질수를 비율별로 혼합하여 실험 시작 시 각 실험구 간별 Ca⁺을 제외하고 SW와 DNW 사이에서는 각 이온들 의 농도 차이가 뚜렷하였다 (Table 1). SW보다 DNW 실험 구 내 이온들의 농도가 모두 높았으며 Cl^- 이온은 SW에 서 16.051±257.7 mg L^-1, DNW에서 20,071±960.6 mg L^-1, SO₄^- 또한 SW에서 가장 낮은 2309±41.4 mg L^-1, DNW에 서 가장 높은 2,309±41.4 mg L^-1를 보였으며 K 이온도 SW 에서 낮은 299±5.9 mg L^-1였고 DNW에서 유의적으로 높 은 331±1.7 mg L^-1의 농도를 보였다. 새우의 삼투압에 영 향을 미치는 요인은 사육수 내의 이온양보다도 그 이온 의 비율에 영향을 받는데 Roy et al. (2007)의 연구에서 새 우 유생의 성장은 Na/K, Mg/K, Mg/Ca의 비율이 자연 해수의 비율 (28.5, 3.7, 3.4)에 근접할수록 좋았지만 범위 를 크게 벗어나지 않는 경우는 생존율에 영향을 미치지 않는다고 하였다. 본 연구에서는 각 실험구에서 Na/K 비 가 32.0~33.6, Na/Cl 0.53~0.63, Mg/K 3.52~3.75, Mg/Ca 3.49~3.77 범위 안에 있어 성장 및 생리적 특성에 영향을 미치지 않는 이온조성으로 조사되었다.

적 요

안정된 바이오플락 사육수에는 대량의 미생물들이 존 재하고 있으며 사육수온이 높아 재사용이 가능할 경우 빠 른 수질안정화 및 에너지 절약을 할 수 있다. 바이오플락 사육수 내 부유하고 있는 자가 및 타가 영양세균은 호기성 과 혐기성 세균을 모두 포함하고 있어 탄소원을 넣고 산소 를 공급하지 않는 혐기성 상태로 만들면 탈질과정이 가능 하다. 본 연구에서 바이오플락 탈질수의 특성은 암모니아 (6.9 mg L^-1), 아질산 (0.3 mg L^-1), 질산농도 (9.2 mg L^-1), 높 은 pH (8.42), alkalinity (590 mg L^-1)였으며 이 탈질수를 첨 가한 사육수의 물리적 환경 변화가 어린새우의 생존 및 생 리적 특성에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과 탈질수를 100% 사용하여도 생존율의 변화를 보이지 않았으나 혈림 프를 포함한 체액 분석결과 탈질수 혼합에 의한 조직손상 및 스트레스 지표인 크레아틴, 혈중 요소성 질소의 증가가 관찰되었고 탈질수 혼합비율이 높을수록 새우 체내 이온 (Na⁺, K⁺, Cl^-)의 농도가 유의적으로 감소하여 향후 삼투 압조절에 영향을 미칠 수 있는 것으로 나타남에 따라 탈질 수를 일정비율로 (50% 미만) 혼합하여 사용하는 것이 바 람직한 것으로 사료된다.