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ISSN : 1226-9999(Print)
ISSN : 2287-7851(Online)
Korean J. Environ. Biol. Vol.37 No.3 pp.389-395
DOI : https://doi.org/10.11626/KJEB.2019.37.3.389

Effects of Anti-Fouling System (AFS) on embryos of a sea urchin, Mesocentrotus nudus

Jin-Young Seo*, Jung Hoon Kang, Jin-Woo Choi
Risk Assessment Research Center, KIOST, Geoje 53201, Republic of Korea
Corresponding author Jin-Young Seo Tel. 055-639-8554 E-mail. jyseo@kiost.ac.kr
26/08/2019 17/09/2019 17/09/2019

Abstract


In this study, we aimed to assess the toxicity of biocide present in antifouling paint on embryos of sea urchin, Mesocentrotus nudus. Three types of biocide (Sea-nine 211, Diuron, and Irgarol 1051) were selected for the exposure experiment. The EC50 of Seanine, Diuron, and Irgarol on the fertilization rate of sea urchin were 32.8 μg L-1, 7,975 μg L-1 and 6,995 μg L-1, respectively. The EC50 of Sea-nine, Diuron, and Irgarol on the development rate of sea urchin were 31.6 μg L-1, 3,044 μg L-1, and 2,267 μg L-1, respectively. The highest toxicity was observed in the presence of Sea-nine.



국내 주상용 Anti-Fouling System 처리 활성물질이 둥근성게 (Mesocentrotus nudus)의 배아에 미치는 영향

서 진영*, 강 정훈, 최 진우
한국해양과학기술원 위해성분석연구센터

초록


    Korea Institute of Ocean Science and Technology
    PE99713

    서 론

    선박의 생물 부착을 막기 위해 방오도료가 개발되어 사 용되어왔고, 이러한 방오도료 내에는 화학 물질 (살조물질) 을 함유하고 있어서 선박외부에 생물이 부착되는 것을 방 지한다 (Boxall et al. 2000;Terlizzi et al. 2001). 1990년대 이 전에는 TBT가 함유된 페인트가 가장 효과적인 anti-fouling 물질로 사용됐으나, 해양환경 및 생물에 미치는 악영향이 알려지면서 1990년대 초반에 전면 사용이 금지되었고, 그 이후 TBT를 대체하기 위한 다양한 방오도료들이 개발되 어왔다 (Alzieu 2000). 그 중 Irganrol 1051, Sea-Nine 211, Diuron, Chlorothalonil 및 Copper pyrithione, Zinc pyrithione 과 같은 기타 금속 화합물이 가장 일반적으로 사용되는 biocide 물질이다 (Konstantinou and Albanis 2004). 이 물질 들은 유기주석물질과 비교할 때 환경적으로 덜 해롭다고 알려져 있으나, 최근 일부 연구들을 통해 이 대체 물질들의 유해성이 알려지고 있는 실정이다 ( Jacobson and Willingham 2000;Sherrard et al. 2003;Braithwaite and Fletcher 2005;Mochida et al. 2010).

    Irgarol 1051 [2-methylthio-4-tert-butylamino-6-cyclopropylaminos- triazine]은 강력한 s-triazine 제초제로 반감기는 해수에서 273일이며, Diuron [3,4-dichlorophenyl-1,1-dimethylurea]은 non-targer species에 잠재적 독성을 지니는 물 질로 반감기는 수중에서 33일이다 (Hall et al. 1999;Amara et al. 2018;Zhang et al. 2019). 이 두 물질은 식물의 광합성 을 저해하고 조류의 엽록체 내 전자 전달을 손상시킴으로 써 방오 작용을 한다 (Moon et al. 2019). 따라서 주로 잘피, 망그로브, 산호와 저서성 microalgae 등에 영향을 미치는 것 으로 알려져 있다 ( Jones et al. 2003;Duke et al. 2005;Negri et al. 2005;Magnusson et al. 2012;van Dam et al. 2012;Holmes 2014).

    Sea-nine 211 [4,5-dichloro-2-n-octyl-3(2H) isothiazolone] 은 수중에서는 24시간 이하, 수중 퇴적물에서는 1시간 이 하로 분해가 빠르고 비교적 짧은 반감기를 가진다 ( Jacobson and Willingham 2000). Sea-nine은 포식세포 (phagocyte) 의 형태를 변형시키고 괴사를 유발할 뿐 아니라 tunicate 혈 구 내 세포골격을 교란하는 작용을 한다 (Moon et al. 2019). 또한 Sea-nine은 Diuron이나 Irgarol에 비해 이매패류, 극피 동물 등의 배아독성, 유생 사망, 면역독성 등을 야기하는 비율이 높은 것으로 알려져 있다 (Kobayashi and Okamura 2002;Cima et al. 2008;Menin et al. 2008;Cima and Matozzo 2010).

    본 연구에서 시험생물로 사용한 성게는 수정 및 발생과 같은 초기 생활사 과정을 독성 실험에 이용하기 때문에, 민감도가 좋고 실험 방법이 간단하여 전 세계적으로 환경 평가 및 모니터링에 많이 이용되고 있다 (Nacci et al. 1986;Dinnel et al. 1987). 성게 배아를 이용한 수정과 발생 실험 은 중금속에 대한 독성, 퇴적물의 오염평가 등에 많이 이용 되고 있으며, 최근에는 방오 페인트의 독성유무 및 살조제 의 독성 평가에도 많이 이용되고 있다 (Meador et al. 1990;Carr et al. 1996;Bellas 2006, 2007;Rial et al. 2016). Biocide 의 독성을 평가하기 위해 성게 (Paracentrotus lividus)의 배아 를 이용하여 Sea-nine과 Irgarol의 발생독성 (EC10, EC50)을 측정하였고 (Bellas 2006, 2007), 보라성게 (Anthocidaris crassispin) 의 배아를 이용하여 Sea-nine, Irgarol, Diuron, CuPT, ZnPT 등의 발생독성을 측정하였다 (Kobayashi and Okamura 2002). 그러나 국내에서는 TBT, Sea-nine, Cu-pyrithione과 Zn-pyrithione가 조피볼락과 단각류에 미치는 영향 (Park et al. 2006) 등 일부 연구가 수행되었으나, 성게 배아 를 이용한 biocide 위해성 평가에 대한 연구는 국내에서는 전무한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 현재 국내외에서 많이 사용되고 있는 biocide 3종에 대한 위해성 여부를 둥 근성게 배아를 이용한 실험을 통해 평가해 보고자 한다.

    재료 및 방법

    1. 실험생물 준비

    실험에 사용된 둥근성게 (Mesocentrotus nudus)는 경남 거 제도 주변해역에서 잠수작업을 통하여 채집하였다. 채집 된 성게 어미를 실험실로 옮겨 2 ton 용량의 수조에 실험이 실시되기 전까지 사육하였고, 사육하는 동안 먹이로는 건 조된 다시마 (Laminaria sp.)를 공급하였다. 실험에 사용 전 까지 사육수의 온도는 20°C로 유지하였다.

    2. 실험 방법

    성게를 이용한 독성실험은 ASTM과 USEPA의 표준지 침서를 Lee (2000)Won (2000)에 의해 수정된 방법을 적용하여 수행되었다. 성게를 이용한 독성 실험의 최종반 응 (endpoint)으로는 수정률과 발생률의 두 가지가 있다. 수정률 실험은 정자를 시료에 노출시켜 정자의 활력이 얼 마나 감소하는지를 알아보는 실험이며, 발생실험은 수정 란을 시료에 노출하여 정상적인 플루테우스 (pluteus)유생 으로 발생되는지 유무를 판단하는 실험법이다 (Fig. 1).

    정자와 알을 어미로부터 얻기 위하여 1 M-KCl 용액 (Lot No. BCBT9546, Sigma-Aldrich, USA)을 어미의 입 주위로 주사하여 산란을 유발하였다. 정자의 경우 파스퇴르피펫 을 이용하여 생식공으로부터 방출되는 정자를 직접 수집 하여 1.5 mL 용량의 원심분리 튜브에 옮겨 담고 실험전까 지 5°C에서 보관하였다. 알의 경우 여과 해수가 담긴 비이 커에 암컷을 거꾸로 뒤집어 놓아 방출된 알이 바닥으로 흘 러내려 가라앉도록 하였다. 수집된 알은 반복적인 세척 과 정을 거쳐 크기가 작거나 미성숙 개체를 제거하였다.

    수정실험을 위해 시료를 각 농도 당 well plate (NuncTM NunclonTM Vita 24-Well Multi-dish, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA)에 1 mL 씩 주입하고, 각 well 마다 50 μL의 정자 희석액을 첨가하였다. 정자를 20분 동안 노출시 킨 후, 각 well 마다 100개의 알이 주입될 수 있게 계수 후 알을 주입하였다. 정자와 알이 만나 수정이 이루어지도록 20분간 더 기다린 후, 10% 완충포르말린 (Lot No. 1C4031, Junsei, Japan)을 100 μL 씩 주입하여 실험을 종료하였다. 실 험이 종료된 후, 알의 바깥쪽에 투명한 막 (수정막)이 형성 되어 있는지 여부를 직접 관찰하여 수정란과 미수정란으 로 구별하였다 (Fig. 2).

    발생실험을 위해 시료를 농도별로 유리 바이알 (20 mL LS Vial, 22-400 Urea Cap, Wheaton, USA)에 5 mL 주입 후 수정란을 mL 당 100개체가 되게 계수 후 주입하여 배양기 (Multi cooling incubator, J-MIC2 type, Jisico, Korea)에서 48 시간, 20°C에서 배양 후 10% 완충포르말린으로 고정 후 실 험을 종료하였다. 종료 후 현미경 (CX31-32L02, Olympus, Japan) 하에서 정상적으로 발생된 개체 (플루테우스 유생), 발생지연, 기형, 사망으로 구분하여 계수하였다 (Fig. 2).

    3. 실험 농도

    실험에는 Biocide 3종; Diuron (Tokyo Kasei Kogyo Ltd, Japan), Irgarol 1051 (Ciba Specialty Chemicals, Japan), Seanine 211 (Rohm and Haas Company, USA)을 사용하였다. 대조구 실험 및 실험구 희석을 위한 해수는 거제도 장목 만에서 채수하여 여과 후 사용하였다. 실험의 농도는 예 비실험을 거쳐 수정률 실험은 Diuron 0.1, 1, 5, 10, 15, 20, 그리고 100 mg L-1, Irgarol 1051은 0.1, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 그리 고 100 mg L-1에서 실험을 수행하였다. Sea-nine 211는 1, 5, 15, 20, 100, 그리고 1,000 μg L-1에서 실험을 수행하였다. 발 생실험은 Diuron과 Irgarol은 100, 1,000, 10,000 μg L-1에서 실험을 수행하였고, Sea-nine은 1, 10, 100 μg L-1에서 실험 을 수행하였다.

    4. 통계 분석

    둥근성게 수정률 및 발생률에 반수영향농도 (50% Effectively Concentration; EC50)은 Trimmed Spearman-Karber, 무 영향농도 (No Observed Effect Concentration; NOEC)와 최 소영향농도 (Lowest Observed Effect Concentration; LOEC) 는 Dunnett’s test를 이용하여 분석하였다. 통계 분석에는 Toxcalc (Tidepool scientific software, USA) 프로그램을 이 용하였다.

    결과 및 고찰

    장목만에서 채수하여 여과한 해수로 진행한 대조실험에 서는 둥근성게 수정률이 97±0.4%로 나타났다. Irgarol은 0.1 mg L-1과 1 mg L-1에서는 모두 수정률이 95% 이상으로 대조구와 통계적으로 차이를 보이지 않았다 (p>0.01). 2 mg L-1에서는 수정률이 88%로 다소 감소하였고, 8 mg L-1 에서는 수정률이 51.5%로 감소하였다. 10 mg L-1에서는 수 정률이 15.7%로 급격히 감소하였고, 100 mg L-1에서는 수정 률이 0%로 나타났다 (Fig. 3). Irgarol의 수정률에 대한 EC50 은 6.9 mg L-1였고, NOEC은 <2 mg L-1, LOEC은 2 mg L-1 였다. 발생 실험 결과, Irgarol은 100 μg L-1에서는 정상적으 로 발생된 pluteus 유생의 비중이 84.1±5.9%였고, 1 mg L-1 에서는 71.0±4.2%였다 (Fig. 4). 10 mg L-1에서는 정상발생 률이 0%였고, 기형 (Malform)의 비중이 92%로 가장 높았 고, 발생지연 (Retard)의 비중은 5%였다. 발생실험에 대한 Irgarol의 EC50은 2.3 mg L-1였고, NOEC은 0.1 mg L-1, LOEC 은 1 mg L-1였다.

    Diuron은 0.1 mg L-1과 1 mg L-1에서는 수정률이 모두 90% 이상으로 나타나 대조구와 통계적으로 차이를 보이지 않았다. 그러나 10 mg L-1와 20 mg L-1에서는 수정률이 각 각 23.9%와 4.1%로 크게 감소하였고, 100 mg L-1에서는 수 정률이 0%로 나타났다 (Fig. 3). Diuron의 수정률에 대한 EC50은 7.9 mg L-1, NOEC은 <5 mg L-1, LOEC은 5 mg L-1 였다. 발생실험에서는 100 μg L-1에서 정상적으로 발생된 pluteus 유생의 비중이 86.4±1.6%였고, 1 mg L-1에서는 84.8 ±2.4%였다 (Fig. 4). 10 mg L-1에서는 정상발생률이 0%였 고, 발생이 전혀 진행되지 않은 Dead 상태를 보였다. 발생 실험에 대한 Diuron의 EC50은 3.0 mg L-1였고, NOEC은 1 mg L-1, LOEC은 10 mg L-1였다.

    Sea-nine 211은 1 μg L-1에서는 수정률이 92.3%로 대조구 와 통계적으로 차이를 보이지 않았으나, 10 μg L-1과 100 μg L-1에서는 수정률이 각각 88%, 82%로 감소하였고, 100 μg L-1에서는 수정률이 0.2%로 급격히 감소하였다 (Fig. 3). Sea-nine의 수정률에 대한 EC50은 32.8 μg L-1였고, NOEC 은 <5 μg L-1, LOEC은 5 μg L-1였다. 발생실험에서는 1 μg L-1에서 정상 발생률이 84.1±5.8%였고, 10 μg L-1에서는 87.8±1.6%였다 (Fig. 4). 100 μg L-1에서는 정상발생률이 0% 였고, 모두 발생이 전혀 진행되지 않은 Dead 상태를 보였 다. 발생실험에 대한 Sea-nine의 EC50은 31.6 μg L-1였고, NOEC은 10 μg L-1, LOEC은 100 μg L-1였다.

    이처럼 둥근성게 배아를 이용하여 3종류의 Biocide에 대 한 위해성 평가를 수행한 결과, 수정과 발생률 모두에서 Sea-nine의 독성이 가장 강한 것으로 나타났고, Irgarol, Diuron의 순으로 나타났다. 현재까지 보고된 연구 결과들 을 살펴보면, Diuron과 Irgarol 1051은 위해성이 Sea-nine 211에 비해 다소 덜한 것으로 나타났고, Sea-nine 211의 독 성이 강한 것으로 나타났다 (Amara et al. 2018). 성게 (Paracentrotus lividus)를 대상으로 발생 실험 (EC50)을 수행한 결 과, Sea-nine의 독성이 Irgarol에 비해 1,000배 이상 높은 것 으로 나타났고, EC10은 2,000배 가량 높게 나타났다 (Table 1). 본 연구에서도 Sea-nine 211이 둥근성게 수정률에 미치 는 영향이 다른 두 종류의 살생물제에 비해 500배 이상, 심 지어 Diuron에 비해서는 1,000배 이상 독성이 강한 것으로 나타나 사용에 주의가 필요할 것으로 판단된다.

    Sea-nine 211은 매우 낮은 농도에서도 담치나 성게 등의 무척추동물의 배발생과 유생의 성장에 영향을 미치는 것 으로 알려져 있다 (Amara et al. 2018). 담치와 굴의 배아발 생에 미치는 영향 (EC50)이 각각 2 μg L-1, 7~24 μg L-1에 불 과해 매우 낮은 농도에서도 해양 무척추동물의 발생 및 성 장과정에 치명적인 영향을 미칠 가능성이 있다. Sea-nine 은 본 연구 결과에서도 나타났듯이 이매패류뿐만 아니라 성게의 배아에도 독성이 매우 심각한 것으로 나타났다. 북 쪽말똥성게 (Strongylocentrotus intermedius)의 배아를 다양 한 살생물제에 각각 노출한 결과, Sea-nine 211에서는 정상 적인 유생 발생률이 급격히 감소하였으며 기형의 발생률 이 매우 높게 나타났으나, Irgarol에 대한 독성은 덜 민감한 것으로 나타났다 (Wang et al. 2011). Diuron은 P. lividus를 대 상으로 한 실험에서 embryo와 sperms에 비해 juvenile 단계 에서의 독성이 강한 것으로 나타났다 (Manzo et al. 2006). 이처럼 Sea-nine에 비해 Diuron과 Irgarol의 독성이 낮은 이 유는 독성기작의 차이 때문인 것으로 판단된다. Irgarol과 Diuron은 수중 이끼제거에 많이 이용되는 제초제로, 주로 freshwater alga, microalgae, marine algae 등 수서 식물에 미 치는 독성이 강한 것으로 나타났다 (Moreland 1980;Okamura et al. 2000;Fernández-Alba et al. 2002;Ma et al. 2002;Braithwaite and Fletcher 2005;Arrhenius et al. 2006;Koutsaftis and Aoyama 2006). Sea-nine은 다양한 해양생물의 초기 발생 및 유생의 성장 등에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 성게는 발생초기 독성에 민감하게 반응하기 때문에 수정 및 배발생과 같은 초기 생활사 단계에서 독성 평가에 많이 이용한다. 종에 따라 다소 차이를 보이지만 대부분의 성게 배아는 24~96시간 동안 배 발생이 진행된다. Sea-nine의 경우 일반적으로 알려진 반감기가 24시간에 불과하다. 짧 은 반감기 등의 영향으로 만성독성의 영향은 거의 나타나 지 않았으나, 급성 독성의 영향은 다양한 수생생물에 광범 위하게 나타났다 (Braithwaite and Fletcher 2005;Arrhenius et al. 2006;Bellas 2006;Yamada 2006;Cima et al. 2008;Wang et al. 2011;Xu et al. 2011). 그러나 현재까지 다양한 해양생 물에 대한 Sea-nine을 포함한 Diuron, Irgarol과 같은 대체 살생물제가 미치는 영향에 대한 독성데이터가 축적되고는 있지만, 비표적 해양생물에 대한 정확한 독성 경로나 메카 니즘이 알려져 있지 않은 상태이다 (Moon et al. 2019). 따 라서 생물에 대한 축적따라서 향후 성게를 비롯한 다양한 생물군에 대한 독성영향평가가 필요할 것으로 판단되며, 이러한 물질들에 대한 관리가 필요할 것으로 판단된다.

    적 요

    본 연구는 둥근성게 (Mesocentrotus nudus)의 배아를 이용 하여 전 세계적으로 많이 이용되고 있는 살생물제 (Biocides) 에 대한 독성 평가를 수행하였다. 실험에 사용한 살 생물제는 총 3종, Sea-nine 211, Diuron, Irgarol 1051이었다. 그 중, 둥근성게 (M. nudus)의 수정과 발생률에 미치는 영 향은 모두 EC50을 기준으로 보았을 때, Sea-nine의 독성이 가장 강한 것으로 나타났고, Irgarol, Diuron의 순으로 나타 났다. 이러한 살생물제, 특히 Sea-nine은 해양무척추동물의 초기 발생과정과 유생의 성장과정에 치명적인 영향이 있 는 것으로 알려져 있으므로 이 물질들에 대한 관리가 필요 할 것으로 판단된다.

    사 사

    본 연구는 한국해양과학기술원의 주요사업인 “한국 주 변 해양생태계 변동 이해 및 대응 기반 연구 (PE99713)”의 지원으로 수행되었습니다.

    Figure

    KJEB-37-3-389_F1.gif

    A schematic diagram for fertilization and development test.

    KJEB-37-3-389_F2.gif

    The normal pluteus larvae and abnormal larvae (left) and fertilized and non-fertilized egg (right) of sea urchin

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    The fertilization rate of the embryos of sea urchin Meocentrotus nudus exposed to biocide (*: p>0.01).

    KJEB-37-3-389_F4.gif

    The percentage composition of the developmental status of Meocentrotus nudus embryos exposed to biocid

    Table

    Comparison of EC10 or EC50 values of single antifouling biocide estimated for Echinoid (unit: μg L-1)

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