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ISSN : 1226-9999(Print)
ISSN : 2287-7851(Online)
Korean J. Environ. Biol. Vol.37 No.4 pp.585-591
DOI : https://doi.org/10.11626/KJEB.2019.37.4.585

Purification and risk assessment of Bacillus thuringiensis Vip3Aa protein against Apis mellifera

Young Jun Jung, Su-Hyang Yoo, Jung Ro Lee*
National Institute of Ecology, Seocheon 33657, Republic of Korea

This authors contributed equally to this work.


Corresponding author Jung Ro Lee Tel. 041-950-5820 E-mail. leejr73@nie.re.kr
14/11/2019 22/11/2019 26/11/2019

Abstract


Most insect-resistant LMOs have been produced by applying Cry and Vip3Aa proteins. Vip3Aa protein is activated during the vegetative stage of Bacillus thuringensis (Bt) and the inhibitory activity of the Vip3Aa protein against pathogenic attacks from lepidopteran insect species is well known. However, a risk assessment of the Vip3Aa protein compared to the Cry protein has not been conducted in South Korea. This study demonstrates a possible risk assessment method for Vip3Aa protein against honeybees (Apis mellifera). For the risk assessment of the protein, we purified the recombinant Vip3Aa protein in Escherichia coli. The survival rate and symptoms of general intoxication of 4 months honeybees were measured after Vip3Aa exposure. These results indicated that there was no significant difference in the survival rate and the symptom between Vip3Aa and the control buffer. In this study, we established standard methods of Vip3Aa protein purification and oral adult toxicity test using A. mellifera as an LMO risk assessment technique for preserving the natural ecosystem of South Korea.



Bacillus thuringiensis 유래 Vip3Aa 단백질 순수분리 및 꿀벌 (Apis mellifera)에 대한 위해성평가

정 영준, 유 수향, 이 중로*
국립생태원 조 사안전연구본부 생태안전연구실

초록


    Ministry of Environment
    NIE-A2019-10

    서 론

    살충성 단백질을 발현하는 Bacillus thuringiensis (Bt) 유전 자가 도입된 해충저항성 유전자변형생물체 (Living modified organisms; LMOs)의 개발은 해충에 의한 작물의 피해 방지를 목적으로 꾸준히 개발되고 있다 (CERA 2012;James et al. 2015). 이들 중 일부는 국내로 수입되어 식품·사료 및 가공용으로 사용되며, 해충저항성 LMO가 소비지로 이동 되는 과정에서 발생할 수 있는 자연환경으로의 비의도적 유출은 생태계 교란 및 생물의 종 감소 등과 같은 부정적인 영향을 미칠 수 있다 (Lee et al. 2007;Park et al. 2007;Park et al. 2018).

    기존에 개발되어 국내로 수입 승인된 대부분의 해충저 항성 LMO는 crystal (Cry) 유전자가 도입된 LM작물이었으 나 최근에는 vegetative insecticidal protein (Vip) 유전자가 도 입된 LM작물 개발 및 수입승인이 증가함에 따라 국내에 비의도적으로 유출되는 사례도 증가하고 있다 (Lee et al. 2015). Vip3Aa 유전자에 의해 합성되는 Vip3Aa 단백질은 789개의 아미노산으로 분자량 88 kDa이며, 인시목 (Lepidoptera) 에 살충성을 보이는 Vip3Aa domain 및 기질 단백 질과 결합하여 활성을 촉진시키는 Carbohydrate binding motif (CBM)으로 구성되어 있다 (Warren et al. 1998;Chakroun et al. 2016). Vip3Aa 단백질은 표적종인 인시목 장에서 62 kDa의 형태로 잘려 활성화되고 중장 돌기에 존재하는 수용체 단백질에 부착하여 장을 마비시키고 외벽을 분해 하여 살충 작용을 나타낸다 (Palma et al. 2014). 국외의 경 우 Vip3Aa 유전자가 도입된 LM 면화 (COT102)와 옥수수 (MIR162)에서 Agrotis ipsilon, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Spodoptera frugiperda 및 기타 여러 곤충에서 Vip3Aa 단백질의 살충활성을 입증하였고 (Estruch et al. 1996;Donovan et al. 2001; Ross et al. 2008; Hutchison et al. 2010;Ali and Luttrell 2011), 환경 방출 시험을 통하여 환경위해성평 가를 보고 했다 (CERA 2012).

    대표적 화분매개 곤충 꿀벌 (Apis mellifera)은 유해물질 및 농약의 간접적인 영향 평가를 위해 이용되고 있으며 LMO의 위해성평가 및 환경위해성평가 대상종으로 이용 되고 있다 (Kim et al. 2009;Lim et al. 2017). OECD에서는 꿀벌 위해성평가 시험으로 급성섭식독성시험, 유충독성시 험, semi-filed 시험 등을 권고하고 있다. 국내에서는 농촌진 흥청고시 제2016-46호에 따라 급성섭식독성시험 생물로 등록되어 있기 때문에 농약 및 유해물질 등 급성섭식독성 시험의 기초자료가 충분히 축적되어 있어 꿀벌을 이용한 위해성평가 연구는 결과의 해석 및 평가에 용이한 장점이 있다. 최근에는 국내 LM 작물 및 LMO 유전산물 (단백질) 에 대한 위해성평가 연구로서 꿀벌이 LM 작물 교잡에 관 여할 수 있으며, LM 콩의 화분 이동에 관여한다는 연구가 보고되었다 (Baek et al. 2010). 뿐만 아니라 RNAi 기법을 이용하여 서부옥수수뿌리벌레를 방제할 수 있는 dsRNA 에 대한 꿀벌의 위해성평가 또한 몇 차례 보고된 바 있다 (Levine et al. 2015;Lim et al. 2017).

    본 연구는 꿀벌에 대한 Vip3Aa 단백질의 위해성을 확인 하기 위해 Vip3Aa 유전자가 삽입된 단백질 과발현 유전자 를 제작하여 Vip3Aa 단백질이 발현되는 최적의 조건을 확 립하였으며, 대량으로 순수분리 할 수 있는 방법을 개발하 였다. 또한 Vip3Aa 단백질에 대한 꿀벌의 급성섭식독성평 가를 수행하여 Vip3Aa 단백질이 꿀벌에 미치는 위해성을 확인하였다.

    재료 및 방법

    1. Vip3Aa 유전자 클로닝

    실험에 사용된 Bt HD-1 Cell line은 충남대학교 농업생명 과학대학 응용생물학과 생물학적 방제연구실로부터 확보 하였다. 클로닝에 사용된 벡터는 pET28a이며, PCR 반응은 정방향 BamHI primer (5ʹ-GGATCC-ATGAACAAGAATAA TACTAAATTAAGCAC-3ʹ)와 역방향 XhoI primer (5ʹ-CTC GAG-TTACTTAATAGAGACATCGTAAAAATGTACA-3ʹ) 를 사용하였다 (Bergamasco et al. 2013;Patricia et al. 2013;Lim et al. 2017).

    2. Vip3Aa 재조합 단백질 정제 및 동정

    Vip3Aa 단백질의 최적의 발현조건을 확인하기 위해 His- Vip3Aa-pET28a 유전자가 도입된 형질전환 대장균을 배양 하는 과정에서 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, Phytotechlab, USA) 0.1~1 mM 농도로 첨가했다. 대장균 파 쇄 후 상층액 부분을 취하여 전체 단백질을 10% SDS-PAGE gel에 전기영동 하였다. Gel상에서 확인된 His-Vip3Aa 단백 질 밴드의 정확성을 확인하기 위해 anti-his (His-Tag (27E8) Mouse, Cell Signaling Technology, USA)를 이용하여 western blot 실험을 수행하였다.

    Vip3Aa 단백질을 대량으로 분리하기 위해 4 L의 LB 배지 에 His-Vip3Aa-pET28a 유전자가 도입된 대장균을 접종하 였다. 세포 배양액의 흡광도 (600 mm)가 0.6에 도달하였을 때 IPTG 0.3 mM를 첨가하여 4~5시간 동안 추가 배양하여 과발현을 유도하였다. 이 후 6,000 rpm으로 6분간 원심분 리 한 후 균체를 수거하여 100 mL의 1 X PBS로 희석했다. 희석된 균체는 sonicator (Q700, Qsonica, USA)를 사용하 여 파쇄하여 8,000 rpm으로 30분간 원심분리 한 후 상층액 을 수거하여 0.45 μm nitro membrane filter system (Corning Syringe Filters, Merck, Germany)으로 여과시켜 수거했다. 수거된 상층액에서 Vip3Aa 단백질을 순수분리하기 위해 Ni-NTA bead (NTA Agarose (25 mL), Qiagen, USA)를 사용 했다. 비특이적 결합 단백질을 제거는 10 mM imidazole (1,3-Diaza-2,4-cyclopentadiene, Glyoxaline, Merck, Germany) 를 사용하였고, Vip3Aa 단백질의 용출은 50 mM imidazole 을 사용하였다. 용출된 Vip3Aa 단백질 fraction들의 분자량 및 순도는 전기영동 gel상에서 확인하였으며, 순도가 높은 Vip3Aa 단백질 fraction들을 모아 fast protein liquid chromatography (FPLC; Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 수행하 여 Vip3Aa 단백질의 순도를 증가시켰다 (Bergamasco et al. 2013;Patricia et al. 2013). 단백질 동정 및 동등성 확인은 (주)제노마인에 의뢰하였다 (Park et al. 2019).

    3. 시험개체 및 시료 준비

    꿀벌 (Apis mellifera)을 이용한 Vip3Aa 단백질 위해성평가 실험을 하기 위해 경상북도 소재지 경농 중앙연구소 실외 에서 약 4개월간 사육, 순화한 꿀벌을 사용하였다. 시험물 질 투여 당일 오전 10시, 시험 대상종 꿀벌을 사육 통으로 부터 채집 후 CO2 gas 이용 2분간 마취하고 시험용기당 10 마리씩 수용하였다. 시험에 사용된 시료는 무처리 (증류수), Hepes (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, Bioshop, Canada) buffer (control, pH 8.0), Vip3Aa 단백질 (1,000 μg) 350 μL와 50% 설탕용액 1,650 μL 혼합하여 각각 의 stock solution을 조제하였다. 꿀벌이 10마리씩 수용된 시험 용기 입구 스펀지에 유리 급식관을 넣고 조제한 시험 물질 0.2 mL 투입하여 꿀벌들이 섭식하도록 하였다. 각각 의 시험물질의 노출 후 2~3시간 경과 시 시험물질의 섭식 을 완료 한 후 50% 설탕용액을 급이 하였다. 꿀벌의 사육 조건은 시험물질의 처리 당일부터 자기 온·습도 기록계 (SATO, Japan)를 이용하여 온도는 24~25°C, 습도는 최저 62% 최고 67%를 유지한 상태에서 진행하였다 (Lim et al. 2017).

    4. 꿀벌 치사율 및 일반중독증상 확인

    Vip3Aa 단백질 노출 당일은 1, 4시간 동안 관찰하고 그 후에는 24, 48시간 동안 관찰하여 더듬이, 날개, 다리 등 움 직임이 없는 꿀벌 개체를 치사개체로 판단하였다. 그리고 기능장애, 운동실조, 혼수, 빈사, 과민반응 등의 증상을 보 이는 개체는 일반중독증상으로 판단하여 수치화 하였다 (Lim et al. 2017).

    결과 및 고찰

    1. Vip3Aa 유전자 클로닝 및 단백질 정제

    환경위해성평가 체계 중 Tier 1 system은 생물종을 이용 한 고농도 실내평가로써 Vip3Aa 단백질이 비표적 생물체 미치는 잠재적 영향을 평가하는 방법이 포함된다. 단계별 로 진행되는 위험성평가 체계에서 Tier 1 system 시험은 “최악의 시나리오”를 시뮬레이션 하도록 설계되는데, 통상 예상 환경 노출량의 10~100배를 처리한다. 고농도 노출에 서 위해성이 발견되지 않는다면 실제 환경에서 발견 가능 한 노출 정도에서는 위해성은 희박하다 (Romeis et al. 2008).

    본 연구에서 우리는 꿀벌에 대한 살충성 Vip3Aa 단백질 의 위해성평가 방법을 마련하기 위해 Vip3Aa 단백질의 특 성을 고려하여 대량으로 순수 분리할 수 있는 기법을 마련 하였다. Vip3Aa 단백질을 대량으로 분리하기 위해 과발현 용 pET28a 벡터를 이용하였고 (Fig. 1a) (Bergamasco et al. 2013;Patricia et al. 2013), 0.3 mM IPTG가 첨가되었을 때 과발현이 최적으로 유도되는 것을 확인하였다. 또한, 우리 는 Vip3Aa 단백질을 분리하는 과정에서 Vip3Aa 단백질이 대장균에서 수용성 상태로 발현되고 있음을 확인하였고 (Fig. 1b, c), 다른 단백질과는 다르게 특이적으로 저농도의 imidazole (50 mM)에서 순수분리 되는 것을 확인할 수 있었 다. 용출된 단백질 fraction은 전기영동 상에서 확인 후 순도 가 높은 fraction만 선택하여 FPLC를 수행한 결과 Vip3Aa 단백질이 고분자 형태로 존재하는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 1d). 또한, 우리는 기존에 알려져 있는 살충성 Vip3Aa 단백질과 순수분리한 Vip3Aa 단백질의 동등성을 확인하 기 위해 MALDI-TOF 분석을 수행하였고, PMF (Peptide Mass Fingerprint) 분석법으로 mass 값이 측정된 peptide들 을 MASCOT software를 이용하여 아미노산 서열을 확인 하였다. 그 결과 Vip3Aa 단백질이 기존에 알려져 있는 살충 성 Vip3Aa 단백질의 아미노산 서열과 일치함을 알 수 있었 다 (Fig. 1e).

    이러한 결과를 통하여 우리는 살충성 Vip3Aa 단백질을 대량으로 순수분리 할 수 있는 방법을 확립하였다.

    2. 꿀벌을 이용한 Vip3Aa 단백질 급성섭식독성 평가

    Vip3Aa 유전자 도입 해충저항성 LMO는 특정 표적 인 시목에 살충성을 보인다 (Schnepf et al. 1998;Donovan et al. 2006;Bravo et al. 2007;Lemes et al. 2017). Vip3Aa 단백질이 곤충의 장 내에서 살충작용을 나타내기 위해서는 활성형 태로 전환되는 최적의 pH와 Vip3Aa 단백질과 결합할 수 있는 수용체 단백질이 존재해야 가능하다 (Estruch et al. 1996;Donovan et al. 2001).

    화분매개 곤충인 꿀벌은 자연생태계에서 작물간 유전자 이동의 매개체가 될 가능성이 있어 중요한 위해성평가종 이지만 (Baek et al. 2010), 꿀벌에 대한 해충저항성 LMO에 서 발현되는 Vip3Aa 단백질의 위해성 연구는 보고되지 않 았다. 우리는 Vip3Aa 단백질에 대한 꿀벌의 위해성을 확인 하기 위해 다음과 같은 급성섭식독성시험을 수행하였다. 꿀벌 10마리가 수용된 시험용기에 Vip3Aa 단백질 (1,000 μg/2 mL)을 0.2 mL씩 투입하여 2~3시간 동안 섭식을 완료 한 후 치사율 및 일반중독증상 확인으로 Vip3Aa 단백질에 대한 꿀벌 위해성 여부를 평가하였다 (Fig. 2). 그 결과, 시험 물질 처리 후 1~48시간 동안 관찰한 결과 무처리군, buffer 및 Vip3Aa 단백질 처리군 모두 치사개체는 발견되지 않았 다 (Table 1). 또한 세 개의 처리군 모두 일반중독증상 역시 관찰되지 않았다 (Table 2). 이러한 결과들을 통해 Vip3Aa 단백질은 꿀벌에 위해성을 나타내지 않는 것으로 판단된 다. 위 결과들은 향후 LM 작물 서식지에 존재하는 초식곤 충, 토양미생물 등의 위해성평가에 활용할 수 있을 것이라 판단된다.

    본 연구를 통해 개발된 Vip3Aa 단백질의 대량 순수분리 방법 및 꿀벌에 대한 급성섭식독성평가 방법은 향후 LM 작물에 도입된 유전자 발현산물이 국내 생물종에 미치는 위해성 평가를 LMO 환경위해성평가 Tier 1 system 단계에 적용시킬 수 있고 체계적인 위해성평가방법 개발을 위한 기초 자료로 활용될 것으로 사료된다.

    적 요

    본 연구는 LMO 유전산물의 위해성평가를 위해 바실러 스로부터 증폭된 Vip3Aa 유전자를 이용하여 대장균에서 단백질 순수분리 하였으며, MALDI-TOP 분석법을 통해 기 존의 알려진 살충성 Vip3Aa 단백질과 동등한 단백질임을 증명하였다. 순수 분리한 Vip3Aa 단백질을 이용하여 꿀벌 과독성 급성섭식독성평가를 수행하였다. 그 결과 무처리 군, Hepes buffer, Vip3Aa 단백질 처리군 모두 치사 및 일반 중독증상을 보이는 개체는 발견되지 않았다. 이 결과를 통 해 Vip3Aa 단백질은 꿀벌에 위해성을 나타내지 않는다는 결론을 얻을 수 있었다. 본 연구 결과는 향후 국내 LMO 유전자 산물 위해성평가에 유용하게 활용될 것이라 사료 된다.

    사 사

    본 연구는 국립생태원 LMO안전관리 과제인 NIE-A- 2019-10 지원으로 수행되었습니다.

    Figure

    KJEB-37-4-585_F1.gif

    Cloning of the Vip3Aa gene and purification of Vip3Aa protein. (a) Vip3Aa gene ligation to the pET28a vector by BamHI/XhoI restriction enzyme digestion. (b) Supernatants after induction with 0.1-1 mM IPTG by 10% SDS-PAGE gels stained with Coomassie Blue. (c) Western blot analysis of IPTG-induced recombinant Vip3Aa protein using anti-polyhistidine. (d) Vip3Aa protein purity increase via SEC. After the SEC fractions were collected, the purity of the Vip3Aa protein was confirmed by performing 10% SDS-PAGE (insert). (e) The trypsin digested Vip3Aa protein peptides were identified by peptide mass fingerprint (PMF) of MALDI-TOF analysis. The trypsin digested peptide fragments of Vip3Aa were analyzed by amino acid sequence via MASCOT software and are indicated as red amino acids (under lines) (http:// matrixscience.com).

    KJEB-37-4-585_F2.gif

    The risk assessment process of Vip3Aa protein against Apis mellifera. Preparation of water, buffer, and Vip3Aa protein for risk assessment against A. mellifera. A. mellifera input to test plot. Treatment of A. mellifera with water, Hepes buffer, and Vip3Aa protein. Observation of the number of dead A. mellifera from 1 to 48 hours.

    Table

    Number of dead honeybees after Vip3Aa protein exposure

    Symptoms of general intoxication to honeybees from Vip3Aa protein treatment

    Reference

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