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서 론
수중의 암모니아는 양식장에서 섭취되지 않고 남은 사 료와 배설물로 인해 발생하며, 고밀도 양식시설에서 높 은 수준으로 존재하여 양식생물에 독성으로 작용할 수 있 다 (Randall and Tsui 2002;Kim et al. 2017a). 암모니아는 이온화된 암모늄 이온 (NH4+)과 이온화 되지 않은 형태 (NH3)로 존재한다 (Ip and Chew 2010). 특히, 비극성 암 모니아 (NH3)는 암모늄 이온 (NH4+)에 비해 지질에 쉽게 용해되지 않는 성질이 있어 매우 높은 독성을 나타낸다 (Roumieh et al. 2013).
암모니아는 어류 체내에 축적되어 독성으로 작용할 뿐 만 아니라 호흡곤란, 평형상실, 경련, 삼투 및 이온조절 실 패와 과민반응을 유발한다 (Kim et al. 2015). 암모니아는 어류 세포막의 칼륨-나트륨 이온 펌프에서 칼륨이온 (K+) 을 대체하여 어류의 수분 조절 및 이온 균형에 악영향을 미친다 (Roumieh et al. 2013). 또한, 높은 수준의 암모니아 는 어류 아가미 조직을 통해 유입되어 신경세포 내 화학 전달물질인 NMDA (N-methyl-D-aspartate) 수용체를 과 활성화하고, 칼슘이온 (Ca2+)과 나트륨이온 (Na+)이 과잉 유입으로 인한 세포 내 Ca2+ 의존성 효소 (Protease, Phospholipase) 를 활성화하여, 세포손상을 유발한다 (Randall and Tsui 2002).
혈액학적 성상은 오염된 환경에 대한 분석을 하기 위해 어류의 건강을 나타내는 주요한 지표이며, 다양한 스트레 스 요인에 의해 영향을 받는다 (Groff and Zinkl 1999;Kim et al. 2019). 따라서 혈액학적 성상은 어류대사 및 병리학 적 변화를 확인할 수 있는 지표이다 (Kim and Kang 2014). 수중의 암모니아 노출에 따른 어류 체내에 증가된 암모니 아는 아가미 조직과 혈관 내 적혈구 사이에 산소 교환을 차단하여, 저산소증을 유발한다 (Robert et al. 1997). 또한 혈액 내에 암모니아는 신장에 축적되어 혈중 암모니아 농 도 및 pH의 증가를 유발한다 (Hrubec et al. 1996). 따라서, 헤모글로빈 및 적혈구 용적과 같은 혈액학적 성상 및 혈장 성분은 암모니아 독성노출에 따른 생물의 생리학적 반응 과 대사 장애의 수준을 판단할 수 있는 중요한 지표가 될 것이다.
대왕범바리 (Epinephelus fuscoguttatus ♀×E. lanceolatus ♂)는 대왕바리 (giant grouper, E. lanceolatus)와 범바리 (tiger grouper, E. fuscoguttatus)의 교잡종으로, 고수온에 내 성 (적수온 25~35°C)이 강해, 고수온 대비 조피볼락 대체 품종으로 현재 양식가능성을 연구 중인 어종이다. 하지만, 대왕범바리에 대한 암모니아 내성 연구는 거의 이루어지 지 않고 있다. 대왕범바리를 우리나라 양식어종으로 안정 적인 대량생산을 위해 환경요소인 암모니아에 대한 기준 적립은 필수적이다. 따라서 본 실험의 목적은 암모니아 급 성노출에 따른 대왕범바리 혈액성상 및 혈장성분의 변화 를 통해 대왕범바리의 암모니아 내성한계를 마련하는데 있다.
재료 및 방법
1. 실험어 및 실험환경
본 실험은 평균 무게 25.7±3.5 g, 평균 전장 11.2±0.9 cm의 대왕범바리 치어를 경남고성 소재의 종묘생산장에 서 분양을 받아 실험을 실시하였다. 실험 전 10일간 실험 실 환경에서 순치시켰으며, 실험에 사용된 해수의 성분은 Table 1과 같다. 암모니아 노출은 NH4Cl (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 표준원액 20,000 mg L-1 를 제조한 뒤, 각 수조에 0, 5, 10, 20, 40 mg L-1의 농도로 급 성으로 96시간 노출을 실시하였다. 사육수조 5개 (100 L 원 형수조)에 각 농도구간별 6마리씩 총 30마리를 입식 후, 노출 96시간 sampling을 실시하였다. 각 노출 실험 수조 의 실제 암모니아 농도는 암모니아 분석용 키트 (Merck & Co., Inc., USA)를 이용하여 24, 48, 72, 96시간 각각 측정하 였다 (Table 2).
2. 혈액학적 성상
암모니아 노출 96시간 후, 혈액학적 분석을 위해 채혈을 실시하였다. 혈액은 헤파린 (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA) 처리된 주사기를 이용해 채취 후, 즉시 적혈구 용적 (Hematocrit)과 헤모글로빈 (Hemoglobin)을 측정하였다. 적혈구 용적은 모세관 내로 혈액을 넣어, Microhematocrit centrifuge (VS-12000, Vision Scientific Co., Ltd., Korea)에서 12,000 rpm, 10분간 원심분리 후 Micro-hematocrit reader를 이용하여 측정하였다. 헤모글로빈수치는 임상용 kit (Asan Pharm. Co., Ltd., Korea)를 이용하여 Cyan-methemoglobin 법으로 측정하였다.
3. 혈장성분 분석
암모니아 노출에 따른 혈장성분의 변화를 분석하기 위 해 채취한 혈액을 4°C에서 3,000×g로 15분간 원심분리 후 혈장을 분리하였다. 혈장 무기성분으로 칼슘 (Calcium), 마 그네슘 (Magnesium)을 측정하였다. 칼슘은 OCPC법, 마 그네슘은 Xylidyl blue-I법에 따라 임상용 kit (Asan Pharm. Co., Ltd., Korea)를 이용하여 측정하였다. 혈장 유기성분으 로 글루코즈 (Glucose), 콜레스테롤 (Cholesterol) 및 총 단 백질 (Total protein)을 측정하였다. 혈당은 GOD/POD법, 콜레스테롤은 비색법, 총 단백질은 Biuret법에 의해 시판 되고 있는 임상용 kit (Asan Pharm. Co., Ltd., Korea)를 이용 하였다. 혈장 효소활성으로 ALP (Alkaline phosphatase)를 측정하였다. ALP는 King-King법으로 500 nm에서 임상용 kit (Asan Pharm. Co., Ltd., Korea)를 이용하여 분석하였다.
4. 통계분석 방법
본 실험분석은 노출물질별 농도에 따른 각 6마리를 분 석에 이용하였고, 모든 분석은 3반복으로 이루어졌다. 실 험 분석 결과에 대한 통계적 유의성은 SPSS 통계 프로 그램 (SPSS Inc.)을 이용하여 ANOVA test를 실시하여 Tukey’s multiple range test를 통해 p<0.05일 때 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
결 과
1. 혈액학적 성상
암모니아 96시간 노출에 따른 대왕범바리의 혈액성상 의 변화는 Fig. 1에 나타내었다. 암모니아 노출에 따른 대 왕범바리 적혈구 용적은 암모니아 20 mg L-1에서 유의적 감소가 나타났다 (p<0.05). 하지만 다른 구간에서는 유의 적 변화는 나타나지 않았다. 대왕범바리 헤모글로빈은 암 모니아 20 mg L-1의 암모니아 노출에 의해 유의적 감소가 나타났다 (p<0.05).
2. 혈장성분
암모니아 96시간 노출에 따른 대왕범바리의 혈장성분 의 변화는 Fig. 2에 나타내었다. 암모니아에 노출된 대왕 범바리 혈장 칼슘은 암모니아 20 mg L-1에서 유의적 감소 (p<0.05)가 나타났지만, 혈장 마그네슘은 유의적 변화는 없었다. 대왕범바리 혈장 글루코즈과 콜레스테롤은 암모 니아 20 mg L-1에서 유의적 증가 (p<0.05)가 나타났다. 대 왕범바리 혈장 총 단백질은 암모니아 노출에 따른 유의적 변화는 나타나지 않았다. 대왕범바리 혈장 ALP는 암모니 아 20 mg L-1에서 유의적 증가 (p<0.05)가 나타났다.
고 찰
혈액학적 성상은 어류의 독성노출에 따른 생리적 변 화를 평가하는 가장 주요한 지표 중 하나이다 (Kim et al. 2017b). 높은 수준의 암모니아 노출은 어류의 혈액에 축 적되며, 어류의 생리적 대사에 영향을 미친다 (Yang et al. 2010). 본 실험에서 대왕범바리 적혈구 용적과 헤모글 로빈 수치는 암모니아 20 mg L-1의 농도에서 유의적으 로 감소했다. Kim et al. (2017a)은 암모니아 노출된 넙치 Paralichthys olivaceus의 적혈구 용적과 헤모글로빈 수치에 서 유의적 감소를, Thangam et al. (2014)는 잉어 Cyprinus carpio에서 암모니아 노출에 따른 적혈구 감소를 보고했 다. Das et al. (2004) 역시 암모니아 노출에 따른 mrigal Cirrhinus mrigala 헤모글로빈의 유의적으로 감소를 보고했 다. 이런 결과는 암모니아 노출은 직접적으로 혈중 암모니 아 축적을 유발하여 혈액 성분에 독성을 유발하여 조혈세 포 손상 및 적혈구 용해 등으로 빈혈 및 무산소증을 유발 했을 것이다. Kim et al. (2017b)에서도 은대구 Anoplopoma fimbria의 적혈구 용적과 헤모글로빈 수치가 현저하게 감 소했으며, 이는 암모니아 노출에 의한 저산소 상태에 따른 조혈세포 손상에 따른 것으로 보고되었다. 본 실험에서 암 모니아 급성노출은 대왕범바리의 혈액학적 성상에 영향 을 주어 유의적 감소를 유발하였으며, 이는 암모니아 독성 에 의한 생리적 변화에 의한 것으로 판단된다.
어류의 혈장 칼슘과 마그네슘은 혈장 무기성분으로 세 포막 이온조절을 통해, 체내 항상성을 유지하는 역할을 한다 (Bijvelds et al. 1998). 혈장 칼슘과 마그네슘은 환경 스트레스에 민감하게 변화하여 증가되거나 감소될 수 있 다 (Kim and Kang 2014). 암모니아 노출은 대왕범바리의 혈장 칼슘 성분의 유의적 감소를 나타내었다. 반면, 혈장 마그네슘의 유의적 변화는 나타나지 않았다. Ruyet et al. (2003)은 암모니아 노출은 turbot Scophthalmus maximus의 이온조절에 영향을 미쳐 혈장 이온 성분의 유의적 변화를 보고했다. 혈장 이온 성분의 변화는 어류의 삼투 조절 등 기본적 생리적 변화를 유발할 수 있으며, 본 연구결과 혈 장 무기 성분의 유의적 변화는 암모니아 급성 노출에 의한 이온 조절 장애에 의한 것으로 판단된다.
혈중 글루코즈 수치는 외부 환경 스트레스에 의해 민 감하게 반응하며 신뢰성 있는 지표로 사용된다 (Lee and Ryu 2011). 본 실험에서, 암모니아 급성 노출된 대왕범바 리의 혈중 글루코즈는 암모니아 노출에 의해 유의적 증 가를 나타났다. 암모니아 노출은 Nile tilapia Oreochromis niloticus의 글루코즈 수치를 유의적으로 증가시켰다고 보 고했다 (Evans et al. 2006). 또한 Cirrhinus mrigala은 암모 니아 노출에 의해 혈중 글루코즈가 유의적 증가를 나타 내었다 (Das et al. 2004). 혈장 글루코즈는 오염물질 노출 에 의해 급격한 증가를 보이는데, 이는 단백질 분해작용인 gluconeogenesis에 의한 것이다 (Leroy and Folmar 1993).
어류 혈중 콜레스테롤은 담즙산 및 스테로이드 호르몬 의 전구체이며 인지질과 함께 세포막의 성분이다. 또한, 콜 레스테롤은 환경변화에 민감하게 변화하며, 환경적 스트 레스를 판단하는 주요한 지표로 이용된다 (Choi and Lee 1992). 본 실험에서 대왕범바리 혈중 콜레스테롤은 암모 니아 노출에 의해 유의적 증가를 나타났다. 다른 연구에 서도 암모니아 노출은 어류의 혈액학적 성상에 영향을 미 치며, 잉어 Cyprinus carpio (Peyghan and Takamy 2002)와 Ctenopharynodon idellus (Xing et al. 2016)에서 혈장 콜레스 테롤의 증가를 보고했다.
혈장 총 단백은 외부 스트레스 요인으로 인한 어류의 건 강상태 악화를 판단하는 주요한 지표이다 (Riche 2007). 정 상적인 경골어류의 경우에서 약 4~7 g dL-1 정도의 농도 범위가 나타나고, 외부 스트레스 등 환경변화에 의해 영 향을 받을 수 있다 (Yanagisawa and Hashimoto 1984). 하지 만, 본 연구에서 암모니아 노출에 따른 대왕범바리 혈장 총 단백의 유의적 변화는 나타나지 않았다. ALP (alkaline phosphatase)는 간 손상 정도를 수치로 나타내는 효소성 분으로, 독성물질에 노출된 어류의 독성 정도를 판단하 는 지표로 많이 사용되고 있다 (Shaheen and Akhtar 2012;Kim and Kang 2016). 본 실험에서 암모니아 급성 노출에 대한 대왕범바리의 혈장 ALP는 암모니아 노출에 의해 유 의적 증가가 나타났다. Peyghan and Takamy (2002)는 잉어 Cyprinus carpio의 암모니아 노출에 따른 혈장 ALP 수치변 화는 대조군보다 높았으며, 이는 적혈구와 신장의 손상에 따른 것으로 보고했다. 본 실험의 대왕범바리의 혈장 ALP 의 유의적 증가는 암모니아로 인해 간세포의 손상에 따른 것으로 판단된다. 본 연구 결과 암모니아 급성노출은 독성 으로 작용하여 대왕범바리의 혈장성분에 영향을 주었다.
적 요
본 실험에서 암모니아 급성 노출은 대왕범바리의 혈액 학적 성상 및 혈장 성분에 유의적 변화를 나타내었다. 본 실험의 결과 20 mg L-1 이상의 급성 암모니아 노출은 대왕 범바리의 혈액학적 성상 및 혈장 성분에 영향을 주어 생 리적 변화를 일으키며, 40 mg L-1의 급성 암모니아 농도는 대량 폐사를 유발할 수 있음을 나타낸다. 향후 대왕범바리 바이오플락 양식기술 적용을 위한 양식연구에 이러한 결 과를 지표로 활용할 수 있을 것이다.
