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ISSN : 1226-9999(Print)
ISSN : 2287-7851(Online)
Korean J. Environ. Biol. Vol.44 No.1 pp.1-13
DOI : https://doi.org/10.11626/KJEB.2026.44.1.001

Lipid accumulation and fatty acid profile remodeling of Chlamydomonas sp. cultivated in piggery wastewater

Eun Bin Joa1, Sang-Ah Lee1,2,3*
1Faculty of Biotechnology, College of Applied Life Sciences, Jeju National University, Jeju 63243, Republic of Korea
2Interdisciplinary Graduate Program in Advanced Convergence Technology and Science, Jeju National University, Jeju 63243, Republic of Korea
3Bio-Health Materials Core-Facility Center, Jeju National University, Jeju 63243, Republic of Korea
*Corresponding author Sang-Ah Lee Tel. 064-754-3346 leesa@jejunu.ac.kr

Contribution to Environmental Biology


▪ This study reveals how the model microalga Chlamydomonas sp. metabolically adapts to ammonia-rich piggery wastewater.


▪ Ammonia-dependent shifts in lipid and fatty acid composition provide foundational knowledge for understanding microalgal responses to high-nitrogen environments.


15/01/2026 24/02/2026 10/03/2026

Abstract


Microalgae-based wastewater treatment has recently emerged as a promising approach for the simultaneous removal of nutrients and production of biomass. However, certain wastewater types, particularly piggery wastewater, contain high levels of ammonia that can be cytotoxic to microalgal cells. In experiments with piggery wastewater adjusted to ammonia concentrations of 45, 65, and 85 mg L-1, Chlamydomonas sp. demonstrated significantly higher removal efficiencies for ammonia and total phosphorus compared to the control medium (BG11 supplemented with equivalent ammonia nitrogen). The microalgal lipid content increased to 38.6% at 65 mg L-1 and reached 44% at 85 mg L-1, depending on the ammonia concentration. Fatty acid methyl ester analysis revealed a higher proportion of C16 : 0 (palmitic acid) at the 65 mg L-1 ammonia level, resulting in a composition favorable for biodiesel production. However, the accumulation of biodiesel-relevant fatty acids was suppressed at the excessive ammonia concentration of 85 mg L-1. In conclusion, this study underscores the metabolic adaptation and lipid regulation of Chlamydomonas sp. in high-nitrogen wastewater environments, providing a foundation for developing microalgae-based wastewater treatment and biomass valorization strategies.


Chlamydomonas sp. , piggery wastewater , ammonia stress , lipid , fatty acids

돈폐수 기반 배양 조건에서 Chlamydomonas sp.의 지질 축적 및 지방산 조성 변화

좌은빈1, 이상아1,2,3*
1제주대학교 바이오소재공학과
2제주대학교 차세대융복합과학기술협동과정
3제주대학교 바이오헬스소재개발연구지원센터

초록

    1. 서 론

    축산업의 확대와 함께 고농도 영양염을 포함한 축산폐수의 배출량이 지속적으로 증가하고 있으며 (Cai et al. 2021), 특히 돈폐수는 암모니아성 질소와 인의 농도가 높아 수계 부영양화, 악취 발생, 지하수 오염 등을 유발하는 주요 환경 오염원으로 알려져 있다 (Li et al. 2019). 이러한 폐수는 부하량이 크고 조성이 복합적이기 때문에 안정적이고 효율적인 처리가 어렵다는 문제가 제기되고 있다 (Zhang et al. 2023).

    현재 고농도 영양염을 포함하는 축산폐수의 생물학적 처리는 박테리아 기반 질소 제거 공정을 중심으로 수행되고 있으며, 해당 공정은 암모니아 산화와 질산화·탈질화로 이어지는 다단계 미생물 대사 경로에 기반하여 안정적인 질소 제거 성능을 확보해 왔다(Lin et al. 2009). 특히 혐기성 소화 공정은 돈폐수로부터 바이오가스를 생산할 수 있어 에너지를 회수할 수 있는 장점을 지니고 있다(Lee et al. 2021b). 그러나 위 과정에서는 외부 유기탄소원의 보충이 요구되는 경우가 있으며 (Vanotti et al. 2012), 처리 과정 중 지속적으로 발생하는 잉여 슬러지는 탈수 및 최종 처분 과정에서 슬러지 케이크 생산량과 탈수제 사용량을 증가시켜 슬러지 관리 및 처리 비용을 상승시키며, 이는 혐기성 소화 공정의 에너지 회수 이점을 부분적 상쇄하는 요인으로 작용한다 (Aichinger et al. 2015). 더욱이 질산화·탈질화 과정에서 발생하는 아산화질소(N2O)는 이산화탄소 대비 높은 온난화 잠재력을 갖는 온실가스로 알려져 있다(Kim et al. 2019). 이로 인해, 미생물 기반 수처리 공정이 잠재적인 온실가스 배출원이 될 수 있음이 보고되고 있다. 따라서, 고농도 암모니아 조건에서의 생물학적 질소 제거는 처리 효율 저하뿐만 아니라 추가적인 기후변화 유발 요인과도 연계될 수 있는 구조적 한계를 내포하고 있다.

    이에 암모니아와 아질산을 동시에 제거할 수 있는 혐기성 암모니아 산화(anaerobic ammonium oxidation, ANAMMOX) 공정이 대안 기술로 제시되고 있으나(Wu et al. 2020), ANAMMOX 균주의 낮은 증식 속도와 배양 조건에 대한 높은 민감성으로 인해 공정 안정성 확보가 어렵고 (Suneethi et al. 2014), 이를 보완하기 위해 부분 질산화-ANAMMOX 공정이나 SHARON (single reactor system for high activity ammonia removal over nitrite)과 같은 전처리 공정이 추가적으로 요구된다(Bagchi et al. 2012;Huang et al. 2020). 이러한 다단계 공정 구성은 공정 복잡성과 운영 부담을 증가시키는 요인으로 작용할 수 있다.

    미세조류는 광합성을 통해 이산화탄소를 고정하는 광독립영양(photoautotrophic) 생물로, 폐수 내 질소와 인을 효율적으로 흡수하여 바이오매스로 전환함으로써 수처리 및 자원화를 동시에 달성할 수 있는 생물학적 플랫폼으로 주목받고 있다 (Delgadillo-Mirquez et al. 2016;Liu and Hong 2021). 또한 다양한 형태의 질소, 인, 탄소 등이 포함된 환경에서 조건 변화에 따라 지질 축적능과 지방산 조성이 변하는 대사적 특징을 보이며(Cicci and Bravi 2016; Fernandes et al. 2016), 이는 폐수 기반 배양 환경에서 나타나는 대사 전환 메커니즘을 탐구하기에 적합한 연구 모델로서의 가능성을 시사한다.

    국내 수질오염물질 배출허용기준에 따르면, 총질소(T-N)는 지역 구분에 따라 30~60 mg L-1 이하로 관리된다 (MOCEE 2025). 반면, 혐기소화된 돈폐수에서는 암모니아성 질소가 약 1,196~3,141 mg L-1 범위로 보고되어 (Kwon et al. 2020), 규제 기준을 현저히 초과하는 고농도 질소 환경을 형성한다. 이러한 고농도 암모니아는 미세조류에 있어 주요 질소원인 동시에, 자유 암모니아(free ammonia, FA) 농도가 증가할 경우 광합성 저해 및 세포 독성을 유발하는 강한 스트레스 인자로 작용하는 이중적 특성을 지닌다 (Chang et al. 2019). 그럼에도 불구하고 암모늄 기반 질소 공급은 미세조류의 탄소 대사, 특히 지질 축적 경로에 영향을 미칠 수 있음이 보고된 바 있다 (Källqvist and Svenson 2003). 이 같은 조건 의존적인 반응은 미세조류 종 특이적이며 환경 조건에 따라 연구 결과의 명확성 및 재현성이 달라질 수 있다 (Huete-Ortega et al. 2018). 따라서 종 특이적 대사 전환 메커니즘을 기본적으로 해석하기 위해서는, 미세조류 종별 암모니아 반응 특성을 규명하는 연구가 필요하다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 본 연구에서는 유전체 정보와 분자생물학적 도구가 잘 구축된 모델 미세조류인 Chlamydomonas sp.를 연구대상 종으로 선정하여 실험을 수행하였다.

    더 나아가, 돈폐수는 일반적인 생활하수나 산업폐수와 달리, 고농도의 암모니아성 질소와 다양한 유기물이 동시에 공존하는 고농도·복합 매질이라는 점에서 미세조류 배양 및 스트레스 반응 연구에 있어 차별적인 특성을 지닌다 (Kim et al. 2016;Minhas et al. 2016). 그러나 실제 돈폐수 환경에서 암모니아 농도 변화를 변수로 설정하여 미세조류의 생장, 지질 축적 및 지방산 조성에 미치는 영향을 체계적으로 규명한 연구는 아직 제한적이다.

    본 연구에서는 모델 미세조류인 Chlamydomonas sp.를 이용하여, 암모니아 농도가 조절된 돈폐수(piggery wastewater, P.W.W.) 환경에서 생장 특성, 영양염 제거 능력, 지질 축적 및 지방산 조성 변화를 분석하였다. 이를 통해 폐수 기반 배양 환경에서 나타나는 암모니아 의존적 대사 조절 특성을 규명하고, 향후 미세조류 기반 폐수 처리 및 바이오매스 생산 연구의 기초 자료를 제공하고자 한다.

    2. 재료 및 방법

    2.1. 미세조류 조류주 및 배양 조건

    Chlamydomonas sp. HNIBR Ma118은 대한민국 전라남도 목포시 소재 국립호남권생물자원관(Honam National Institute of Biological Resources, HNIBR)에서 분양받아 사용하였다. 해당 조류주를 BG11 배지 2 L가 담긴 광생물 반응기(Marado-05D-PS; BIOCNS, Korea in Bio-Health Materials Core-Facility, Jeju National University)에 접종하여 초기 접종량 0.2 g L-1, 공기 주입속도 1 vvm (CO2 20 mL min-1; 1%), 광량 240 μmol m-2 s-1, 온도 25°C에서 배양하였다. 동일한 생리적 상태를 확보하기 위해 건조중량 기준 정체기 초반(early stationary phase) 시점의 조류주를 수확하여 실험에 사용하였다.

    2.2. 시료 성분 분석

    암모니아성 질소(NH3-N), 총인(total phosphorus, TP) 및 총유기탄소(total organic carbon, TOC)는 수질 분석용 시험 키트(C-MAC, Daejeon, Korea)를 이용하여 분석하였다. NH3-N은 알칼리 조건에서 암모니아와 Nessler 시약이 반응하여 생성되는 착색 복합체의 흡광도를 측정하는 Nessler법에 기반하여 정량하였고 (APHA 1980), TP는 산성 과황산 분해를 통해 모든 형태의 인을 인산염으로 전환한 후 chromotropic acid법을 이용한 비색 분석으로 측정하였다 (Rand et al. 1976). TOC는 시료 내 유기탄소를 이산화 탄소로 산화한 후 비색법으로 정량하는 persulfate digestion method에 기반하여 분석하였다 (Mopper and Qian 2006). 흡광도는 분광광도계(QR-200; C-MAC, Daejeon, Korea)를 이용하여 측정하였으며, 각 항목의 결과는 최소 4회 반복 측정의 평균과 표준편차로 나타내었다.

    2.3. 돈폐수 조성 및 전처리

    돈폐수는 제주특별자치도 서귀포시 대정읍 동일리 (33°15ʹ38.8ʺN, 126°14ʹ27.4ʺE)에서 2024년 8월에 채수하였다. 본 연구는 미세조류 외의 미생물에 의한 영양분 제거 가능성을 배제하기 위해, 돈폐수를 121°C에서 15분간 고압증 기멸균 처리하였다. 해당 멸균 조건은 표준적으로 사용되며, 미생물 및 포자 형성 미생물을 효과적으로 불활성화하는 것으로 보고되어 있다 (Lauer et al. 1982;APHA 2012). 채수 시점에서의 온도와 pH는 각각 28.3°C와 8.84였으며, 멸균 처리 후 분석한 암모니아성 질소(total ammoniacal nitrogen, TAN), 총인(TP), 총유기탄소(TOC) 농도는 각각 1,150 mg L-1, 140 mg L-1, 3,069 mg L-1로 나타났다. 해당 분석은 앞서 기술한 시료 성분 분석 방법에 따라 수행하였다.

    2.4. 암모니아 독성 테스트

    본 연구에서 암모니아 농도는 총 암모니아성 질소(TAN) 기준으로 NH3-N 농도 (mg L-1)로 환산하여 사용하였다. 암모니아 독성 테스트는 분광광도계(SpectraMax iD3; Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 이용하여 680 nm에서의 광밀도(OD680)를 측정함으로써 수행하였다. 총 4개의 96-well plate를 사용하였으며, 각 plate별 초기 바이오매스 농도는 각각 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 g L-1로 설정하였다. 각 plate 내 12개의 반복구에서 암모니아 농도를 0, 15, 30, 45, 60, 75 및 90 mg L-1로 설정하였으며, 이는 ammonia solution을 단계적으로 희석하여 조정하였다. 배양 24시간 후 각 well의 OD680 값을 측정하였으며, 대조군 (control, 0 mg L-1)의 값을 100% 생존값으로 기준하여 상대 생존율을 백분율(%)로 환산하였다. 억제농도(inhibition concentration, IC) 중 IC10, IC50 및 IC90 값을 OD680 기반 생존율(%)을 이용하여 four-parameter logistic model에 따른 비선형 회귀 분석으로 산출하였으며, 농도-반응 곡선 피팅은 log [TAN] M을 기준으로 수행한 후 TAN의 몰 질량 (14 g mol-1)을 이용하여 mg L-1 (as NH3-N)로 환산하였다.

    2.5. 돈폐수 암모니아 조건별 배양 설계

    암모니아 독성 테스트 결과를 바탕으로 돈폐수의 암모니아 농도를 45 mg L-1, 65 mg L-1, 85 mg L-1로 설정하였으며, 양성 대조군으로 질산염이 없으며, 암모니아만을 질소원으로 갖는 BG11-ammonia nitrogen 배지를 암모니아 농도 65 mg L-1로 설정하였다. Working volume 400 mL 기준으로 초기 접종 농도 0.63 g L-1로 조정하였다. 이는 앞선 암모니아 독성 테스트 생존율을 고려해 더 높은 처리 값을 도출하기 위한 기준이다. 0.5 L의 원추형 끝을 가진 원통형 광생물 반응기(conical ended photobioreactor)에서 공기 주입속도 0.25 vvm (CO2 10 cc min-1; 1%), 광도 150 μmol m-2 s-1, 온도 25°C 조건에서 진행하였다. 모든 측정은 12시간 간격으로 실시하였다.

    2.6. 총 지질 함량 분석

    총 지질은 Bligh and Dyer 방법에 기반한 chloroformmethanol- distilled water (1.0 : 1.0 : 0.9, v/v/v) 혼합 용매 추출법으로 분석하였다 (Bligh and Dyer 1959). 각 시료별 건조중량 기준 100 mg의 미세조류를 4 mL의 증류수로 현탁 시킨 뒤, chloroform 5 mL와 methanol 10 mL를 첨가하였다. 혼합액은 5분간 교반 후 1분간 초음파 분산하였으며, 120 rpm으로 설정된 진탕배양기에서 overnight 동안 추출을 수행하였다. 추출 후, 시료에 chloroform 5 mL와 증류수 5 mL를 추가하여 1분간 교반한 다음, 4°C에서 4,000 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후 하단층의 chloroform층 (lipid-containing phase)을 회수하여 사전 계량된 알루미늄 접시에 옮긴 뒤, 용매를 자연 증발시켰다. 건조 후 접시의 무게를 측정하여, 총 질량에서 사전 계량 값을 차감함으로써 총 지질량을 산출하였다.

    2.7. Fatty acid methyl ester (FAME) 추출 및 성분 분석

    지방산은 Sasser의 방법에 따라 메틸화 반응을 통해 Fatty acid methyl ester로 전환한 후 분석하였다 (Sasser 1990). 시약 1 (비누화용; sodium hydroxide 45 g, methanol 150 mL, distilled water 150 mL), 시약 2(메틸화용; 6.00 N hydrochloric acid 325 mL, methanol 275 mL), 시약 3(추출용; hexane 200 mL, methyl tert-butyl ether (MTBE) 200 mL), 시약 4(세척용; sodium hydroxide 10.8 g, distilled water 900 mL)를 조성하였다. 각 시료별 건조중량 기준 미세조류 10 mg을 유리 바이알에 넣고 시약 1 (1 mL)을 첨가한 후 교반하였다. 시료는 100°C의 수조에서 5분간 가열한 뒤 10초 간 교반하고, 동일한 온도에서 25분간 추가 가열한 후 실온에서 냉각하였다. 냉각된 시료에 시약 2 (2 mL)를 첨가하여 교반한 뒤, 80°C에서 가열하고 얼음에서 신속히 냉각하였다. 시약 3 (1.25 mL)을 시료에 첨가하고 10분간 교반기에서 혼합 (inverting)한 뒤, 하층액을 제거하였다. 마지막으로 시약 4(3 mL)를 첨가하여 5분간 교반한 후, 상층의 hexane 층(FAME 함유층)을 회수하였다. 분리된 시료는 FAME 분석을 위해 한국생명공학연구원 전북분원(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Jeonbuk Branch, Korea)에 의뢰하여 가스크로마토그래피(GC)로 분석하였으며, 지방산 조성에 기반한 바이오디젤 품질 지표(세탄가, 비누화값, 요오드값, 불포화도 지수 및 산화 안정성)는 GC를 통해 분석된 FAME 조성 결과를 이용하여 기존에 보고된 계산식에 따라 산출하였다 (Islam et al. 2013;Aslam et al. 2018). 산출된 지표는 유럽 바이오디젤 규격인 EN 14214 기준과 비교하여 평가하였다 (European Committee for Standardization 2004).

    2.8. 통계 분석

    실험은 2회 반복으로 진행하였으며, 하나의 모델당 최소 2회의 반복 수행으로 평균치와 표준편차를 나타내었다. 통계 분석은 R (version 4.1.1.)을 이용하여 수행하였다. 각 실험 항목에 대한 처리구 간의 통계적 유의성을 검정하기 위해 일원분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였으며, 유의한 차이가 관찰된 경우 Tukey’s honestly significant difference (HSD) 검정을 이용해 사후분석을 수행하였다. 모든 분석에서 유의수준은 p-value<0.05로 설정하였다. 시각화는 ggplot2 (version 4.0.0) 패키지를 이용하여 수행하였으며, 통계적 유의성은 p-value<0.05, p-value<0.01, p-value<0.001 수준에서 각각 *, **, ***로 그래프에 표시 하였다.

    3. 결과 및 고찰

    3.1. 암모니아 독성 테스트

    암모니아 독성 조건에서 Chlamydomonas sp.의 생존율은 초기 바이오매스 접종 농도에 따라 뚜렷한 차이를 보였다. 초기 접종 바이오매스 농도가 0.2~0.8 g L-1로 증가함에 따라 암모니아 농도에 대한 생존율 곡선이 완만해지는 경향이 관찰되었으며 (Fig. 1a~d), 24시간 배양 후 측정한 OD680 값 또한 초기 접종 농도에 따라 유의한 차이를 나타냈다 (Fig. 1e). 초기 바이오매스 농도의존적 독성 효과가 완화되는 경향을 보였으나, 암모니아 노출 농도에 따른 세포 독성 반응의 차이를 정량화하기 위해 접종 바이오매스 농도별 암모니아 독성 수준을 용량-반응 곡선(dose-response curve)으로 구축하여 생존율-농도 관계를 기반으로 억제농도 (IC)를 산출하였다. 산출한 IC 값을 IC10, IC50 및 IC90으 로 구분하여 표기하였다 (Table 1).

    최적의 초기 접종 농도를 선정하기 위해 0.4와 0.6 g L-1 조건에서의 독성 반응을 비교 분석하였다. 이는 두 조건에서 산출된 IC10, IC50 및 IC90 값의 역전 현상이 나타났기 때문이다. 그러나 이는 해당 조건에서 암모니아 독성에 대한 전체적인 생존율이 낮았음을 의미하는 것은 아니며, 실제로 0.6 g L-1 조건은 동일한 암모니아 농도 범위에서 0.4 g L-1 조건보다 전반적으로 높은 OD680 값을 유지하여, 절대적인 생존 수준은 더 높은 것으로 나타났다 (Fig. 1e). 이러한 결과는 0.6 g L-1 조건에서 암모니아 독성에 대한 반응이 특정 농도 이상에서 급격히 나타나기보다는, 비교적 낮은 농도 구간부터 완만하게 진행되는 암모니아 노출 농도에 의존적인 감수성을 갖는 것으로 파악된다. 즉, 독성 반응의 개시 시점이 상대적으로 앞당겨진 반면, 고농도 영역에서의 생존율은 보다 안정적으로 유지되어, 용량-반응 곡선(doseresponse curve)의 수치적 fitting value에 따라 IC 값이 전반적으로 낮게 산출된 것으로 해석할 수 있다. 이러한 IC 분석 결과와 생존율 패턴을 종합적으로 고려하여, 본 실험에서는 암모니아 농도 의존실험에서 안정적인 억제농도 기반 바이오매스 생존율을 보여준 0.6 g L-1로 설정하였다. 이는 해당 조건이 암모니아 독성에 대해 완만한 반응 곡선을 보이면서도, 고농도 구간에서의 생존 능력을 효과적으로 확보할 수 있음을 의미한다.

    초기 바이오매스 농도에 따른 암모니아 독성 반응을 종합적으로 비교한 결과, 0.4, 0.6 및 0.8 g L-1 조건은 각각 상이한 반응 특성을 나타내었다. 0.4 g L-1 조건은 상대적으로 낮은 세포 밀도로 인해 초기 광 이용 측면에서는 유리할 수 있으나, 본 연구에서 설정한 고농도 암모니아 조건(≥45 mg L-1)에서는 생존율이 급격히 감소하여 사실상 유지되지 못하였다. 이에 따라 해당 조건은 고부하 암모니아 환경에서 안정적인 배양 조건으로 적용하기에는 한계가 있는 것으로 판단되었다. 반면 0.8 g L-1 조건은 암모니아 독성에 대한 생존 안정성이 가장 높게 나타났으나, 해당 수준의 바이오매스를 확보하기 위해 상대적으로 긴 배양 시간이 요구되었다. 또한 선행 연구에 따르면 미세조류를 고농도의 초기 바이오매스로 접종할 경우 세포 밀도 증가에 따라 배양 초기 단계에서 광 투과율이 저해되어 성장 효율이 감소할 수 있는 것으로 보고된 바 있다(Thanh et al. 2015). 결과적으로 0.6 g L-1 조건은 고농도 암모니아 환경에서도 안정적인 생존력을 유지함과 동시에, 과도한 차광 효과에 의한 생장 저해를 최소화할 수 있는 최적의 조건으로 판단되었다. 따라서 본 연구에서 초기 바이오매스 농도로 0.6 g L-1를 선정하였다. 이후, 고농도 암모니아 환경에서의 생리· 대사 반응을 평가하기 위한 단계적 스트레스 실험을 진행하였다. IC10~IC90 분석 결과는 단순 배양 조건에서 암모니아 민감도를 정량적으로 파악하기 위한 기준선으로 활용하였으며, 이는 실제 폐수 환경에서의 절대적 생존 한계를 의미하지 않는다. 특히 돈폐수는 유기물, 이온 조성 및 완충능 등 복합적인 매질 특성으로 인해 암모니아의 실효 독성이 단순 배지보다 완화될 수 있어, 동일한 NH3-N 농도에서도 생존 가능 범위가 달라질 수 있다. 이러한 점을 고려하여 본 연구에서는 미세조류가 생존은 가능하되 명확한 스트레스 반응이 유도되는 농도 범위를 평가하기 위해, 고농도 스트레스 개시점에 해당하는 45 mg L-1, 중등도 이상의 독성을 나타내는 65 mg L-1, 그리고 극한 수준인 85 mg L-1를 실험 농도로 설정하였다.

    3.2. 암모니아 농도 구배에 따른 돈폐수 처리 결과

    3.2.1. 생장 측정 결과

    초기 12시간 동안은 암모니아 노출 및 배양환경 변화의 영향으로 모든 처리군에서 바이오매스 농도가 암모니아 독성에 의해 일시적 감소 경향을 보였다(Fig. 2a). 이후 24시간 시점부터는 모든 처리군에서 바이오매스 회복이 관찰되었으며, 특히 P.W.W. 처리군에서 Chlamydomonas sp.는 이후 48시간(배양 종료시점)까지 지속적인 증가 추세를 나타내었다. 반면, 일반 배지에서 암모니아만을 질소원(BG11- ammonia nitrogen)으로 사용한 대조군은 24시간 이후 감소하는 양상이 확인되었다.

    실제 돈폐수는 높은 이온 강도와 유기물 함량을 갖는 복합 매질이므로, 단순히 수온과 pH에 근거하여 산출된 암모니아의 유효 독성 범위가 실제 미세조류에 미치는 영향력을 온전히 반영하지 않을 수 있다 (Moerland et al. 2021). 고이온 강도 조건에서는 NH3 및 NH4+의 활동도 계수(activity coefficient)가 감소함에 따라, 동일한 총 암모니아 농도에서도 자유 암모니아의 유효 활성도가 낮아지는 경향을 보인다. 또한 폐수에 포함된 유기물은 NH4+와의 결합을 통해 이를 부분적으로 비가용화시키며, 이러한 유기물-양이온 상호작용은 자유 암모니아 형태의 비율을 추가적으로 감소시키는 방향으로 작용한다 (Moerland et al. 2021). 이러한 매트릭스 효과를 종합적으로 고려할 때, 동일하거나 더 높은 암모니아 농도 조건에서도 P.W.W. 처리군에서 미세조류의 생장이 유지된 것은 폐수 특유의 물리화학적 특성이 암모니아 독성을 부분적으로 완화했기 때문으로 해석된다.

    추가로, 돈폐수에는 acetate, propionate, butyrate와 같은 단쇄지방산(short-chain fatty acids, SCFAs)이 공존하는 복합 매질 환경이 형성되는 경우가 많다 (Zhang and Jahng 2010). 특히 acetate는 세포 내로 직접 흡수되어 탄소 대사 및 호흡 경로를 통해 ATP와 환원력(NAD(P)H) 생성에 기여함으로써, 암모니아 스트레스 하에서 요구되는 기본적인 대사적 손실 상쇄가 가능한 인자로 보고되었다 (Lauersen et al. 2016). 이러한 관점에서, SCFAs를 포함하는 폐수 환경은 단순히 암모니아 독성을 완화하는 물리·화학적 완충 역할뿐만 아니라, 미세조류가 고암모니아 조건에 적응·유지하기 위한 대사적 여지를 제공하는 환경임을 시사한다. 실제로 희석된 돈폐수 환경에서 배양된 녹조류가 표준 배지(BG11) 조건과 비교하여 최대 광화학 효율(Fv/Fm)에 유의미한 차이를 보이지 않았으며, 이는 고암모니아를 포함하는 복합 폐수 환경에서도 광합성 시스템이 안정적으로 유지되고 세포가 생리적으로 양호한 활성을 유지할 수 있음을 보여준다 (Zittelli et al. 2022).

    3.2.2. 암모니아성 질소 제어

    BG11-ammonia nitrogen 배지에서는 48시간 동안 초기 농도 대비 약 2.3% 수준의 암모니아만 제거되었으나, P.W.W. 조건에서는 암모니아 제거효율이 현저하게 높게 나타났다 (Fig. 2b, Table 2). P.W.W. 45 mg L-1 조건에서는 67.8%, 65 mg L-1에서는 50.8%, 85 mg L-1에서는 40.3%의 제거효율을 기록하여, 모든 농도에서 BG11-ammonia nitrogen 대비 월등한 제거효율을 보였다. 이러한 결과는 멸균된 돈폐수 조건에서 Chlamydomonas sp.가 BG11-ammonia nitrogen 배지에 비해 암모니아 제거효율이 크게 향상될 수 있음을 보여준다. 이는 P.W.W. 내에 존재하는 다양한 용존 유기물 및 무기 성분이 미세조류의 생리적 활성과 질소 동화 과정을 촉진했기 때문으로 해석할 수 있다. 정의배지(defined media)인 BG11-ammonia nitrogen에서는 미세조류가 활용가능한 영양염 간 간섭이 최소화된 형태로 영양염이 존재하는 반면, P.W.W.와 같은 복합 매질 조건에서는 잔존 유기탄소 및 미량 무기원소가 함께 존재하여 세포 성장 및 질소 흡수에 보다 유리한 환경을 제공했을 가능성이 있다. 이를 명확히 규명하기 위해서는 총유기탄소(TOC) 변화, 미량 무기원소 등의 이화학 분석이 추가 요구된다.

    3.2.3. 총인 (TP) 제거 결과

    P.W.W. 조건에서는 시간 경과에 따라 TP 농도가 대조군 대비 감소하였으며, 48시간 후에는 BG11-ammonia nitrogen 배지보다 높은 제거효율을 나타냈다(Fig. 2c). 특히 65 mg L-1 조건에서 가장 높은 TP 제거가 관찰되었는데, 이는 특정 돈폐수 환경에서 영양염 흡수가 상대적으로 효율적으로 이루어졌음을 시사한다(Table 2). 다만, 실험 설계상 암모니아 농도를 기준으로 폐수를 희석함에 따라 대조군과 P.W.W. 처리군 간의 초기 TP 농도 차이가 발생하였으며, 이러한 농도 구배가 제거율 산출에 변수로 작용했을 가능성이 있다. 그러나 모든 처리군에서 TP가 완전히 소모되지 않았다는 점을 고려할 때, TP 농도는 본 배양 조건에서 세포 성장의 제한 요인으로 작용하지 않은 것으로 판단된다.

    3.2.4. 총유기탄소 (TOC) 제거 결과

    BG11-ammonia nitrogen 조건은 외부 유기탄소원을 포함하지 않는 무기배지이나, 본 연구에서 보고한 TOC는 미세조류 배양액을 여과한 시료를 대상으로 측정된 값으로서, 세포를 제거하더라도 배양 과정에서 방출된 용존 유기 탄소 (DOC; 세포 외 고분자물질 (EPS) 및 저분자 유기물 등)는 여과 후에도 잔존할 수 있다. 특히 암모니아는 미세 조류의 생리적 스트레스를 유발하여 세포 외부물질 분비 및 용존 유기물 방출을 증가시킬 수 있으므로 (Chen et al. 2022), 무기배지 조건에서도 일정 수준의 TOC가 검출될 수 있다. 또한 TC-IC 기반 TOC 분석은 시료 내 무기탄소 함량 및 매트릭스 특성에 따라 측정 오차가 발생할 수 있으며, 이에 따라 절대값 해석에 일정 수준의 불확실성이 존재할 수 있다 (Kim and Kim 2025). 따라서 BG11-ammonia nitrogen 조건에서 관찰된 TOC는 배양 과정 중 형성된 용존 유기탄소(DOC)를 주요 기원으로 하되, 분석적 한계를 고려하여 조건 간 용존 탄소 거동을 참고적으로 해석하였다.

    48시간 후 BG11-ammonia nitrogen 배지 (TAN 65 mg L-1)에서는 TOC가 14.5% 감소하였으나, 이는 유기탄소를 포함하지 않는 무기배지 특성상 유의한 유기물 제거로 해석하기에는 제한적이다. 한편 P.W.W. 처리군에서는 설정된 암모니아 농도가 증가함에 따라 폐수 희석 비율이 감소하여 초기 유기물 부하 또한 함께 증가하였다. 이러한 조건에서 48시간 후 TOC 감소율은 45, 65 및 85 mg L-1 처리군에서 각각 10.5%, 19.0% 및 25.5%로 단계적으로 증가하였다. 이러한 경향은 암모니아 농도 증가와 함께 초기 유기물 부하 수준이 달라진 조건에서, 배양 시스템 내 용존 유기탄소의 거동이 조건별로 상이하게 나타났음을 시사한다. 실제로 Chlamydomonasreinhardtii는 CO2를 이용한 광독립영양뿐 아니라, 아세테이트(acetate)와 같은 유기탄소원을 이용한 종속영양/혼합영양 성장이 가능한 모델 녹조류로 잘 알려져 있다 (Bertoni 2013). 특히 유기탄소가 존재하는 혼합영양 조건에서는 무기탄소와 유기탄소의 동시 동화가 가능하며, 광합성을 통해 공급되는 에너지(ATP)와 환원력(NADPH)이 유기물 흡수 및 대사 효율을 극대화하는 방향으로 작용한다(Ma et al. 2023). 이러한 선행 연구 결과를 고려할 때, 본 연구의 P.W.W. 조건에서 관찰된 TOC 감소 역시 폐수 매질 내 유기물 존재 하에서 미세조류의 탄소 대사 반응이 복합적으로 작용했을 가능성으로 해석될 수 있으며, 이는 실제 폐수 환경에서 Chlamydomonas sp.가 유기물 및 영양염 제거와 함께 생장을 유지할 수 있음을 보고한 기존 연구와도 정성적으로 일치한다 (Mohd et al. 2024).

    3.3. 지질 축적

    암모니아 농도별 폐수 (P.W.W.) 처리 조건에서 Chlamydomonas sp.의 세포 내 지질 함량 변화는 Figure 3에 나타내었다. 독성이 없는 NO3 형태의 질소원이 상대적으로 충분한 일반 BG11 조건 (N≈250 mg L-1)에서는 지질 함량이 10.6% 수준으로 유지된 반면, BG11-ammonia nitrogen에서는 지질 함량이 7.05%로 소폭 감소하였다. 이러한 결과는 무기배지에서의 암모니아 스트레스가 지질 축적을 유도하기보다는 생장 및 광합성 기능 저해에 우세하게 작용했을 가능성을 시사한다. 반면 P.W.W.는 유기물(TOC) 및 다양한 이온·미량성분을 포함하는 복합 매질로서, 유기탄소의 가용성(혼합영양 가능)과 매트릭스에 의한 자유 NH3 활성 저하가 결합되어, 동일 TAN에서도 세포 생존이 유지되면서 지질 축적이 상대적으로 촉진된 결과로 해석된다(Moerland et al. 2021).

    Chlamydomonas sp.의 지질 함량이 암모니아 농도 및 배양 매질의 특성에 따라 크게 달라져, 돈폐수의 배양환경이 미세조류 세포 내 지질 축적을 현저히 강화했다는 점을 보여준다. 이는 돈폐수를 활용한 미세조류 배양 공정이 수처리와 동시에 고부가가치 바이오매스를 생산할 수 있는 비용 효율적인 생물학적 플랫폼으로서 높은 잠재력을 가짐을 시사한다. 따라서 폐수 처리와 바이오디젤 원료 생산을 동시에 달성할 수 있는 미세조류 활용 공정의 적용 가능성을 뒷받침하는 결과로 해석된다.

    3.4. FAME 분석

    3.4.1. FAME 조성 분석

    미세조류 기반 바이오디젤 원료 생합성을 평가하기 위해 FAME 분석을 진행하였다(Fig. 4). 특히 팔미트산(C16:0) 과 올레산(C18:1)은 미세조류의 중성지질(TAG)을 구성하는 대표적인 지방산으로, 바이오디젤 품질에 중요한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Hu et al. 2008;Ramos et al. 2009). 일반적으로 C16:0과 같은 포화지방산은 산화 안정성을 향상시키는 반면, 비율이 높을 경우 저온 유동성을 저하시킬 수 있다. 단일불포화지방산인 C18:1은 산화 안정성과 저온 유동성 간의 균형 측면에서 바이오디젤 원료로서 상대적으로 유리한 지방산으로 평가할 수 있다. 환경 변화에 노출된 미세조류는 세포 항상성 유지를 위해 대사 경로를 재조정하며, 그 결과 특정 지방산의 상대적 비율이 변동하는 것으로 보고된 바 있다 (Yun et al. 2025). 이에 본 연구에서는 암모니아 스트레스 조건에 따른 지방산 조성 변화를 중심으로 비교·분석하였다.

    대조구에서는 다양한 지방산이 비교적 고르게 분포하였으나, 바이오디젤 품질에 유리한 C18:1의 비율은 상대적으로 낮게 나타났다. BG11-ammonia nitrogen에서는 C16:0의 비율이 크게 증가하여 지방산 조성의 뚜렷한 변화를 보였으나, C18:1의 증가는 제한적이었다. 또한 해당 조건에서는 높은 암모니아 스트레스로 인해 바이오매스 축적이 제한적이었던 점을 고려할 때, 지방산 조성 측면의 이점이 실제 생산성 향상으로 직결되기에는 한계가 있을 것으로 판단된다.

    돈폐수 (P.W.W.) 조건에서는 암모니아 농도에 따라 지방산 조성이 단계적으로 변화하는 양상이 뚜렷하게 관찰되었다 (Fig. 4). 특히 암모니아 농도 45 및 65 mg L-1 조건에서 C18:1의 상대적 비율이 대조구 대비 증가하였으며, 65 mg L-1 조건에서 가장 높은 값을 나타내었다. 반면, 가장 높은 암모니아 농도인 85 mg L-1 조건에서는 C18:1의 비율이 감소하여, 과도한 암모니아 스트레스는 오히려 단일불포화지방 산 축적에 부정적인 영향을 미칠 수 있음을 시사하였다. 이러한 비선형적 반응은 중간 수준의 암모늄 조건에서 C18:1 비율이 최대에 도달한 후, 고농도에서 감소하는 경향을 보고한 선행 연구와도 일치한다 (Farahin et al. 2021). C16:0의 경우 조건별 변동은 관찰되었으나 암모니아 농도에 따른 일관된 증가 또는 감소 경향은 나타나지 않았다. 종합하면, 적정 수준의 암모니아 스트레스(45~65 mg L-1)는 바이오 디젤 품질에 유리한 단일불포화지방산(C18:1) 중심의 지방산 조성을 유도하는 반면, 과도한 암모니아 스트레스 조건에서는 해당 효과가 감소하는 것으로 판단된다. 이는 지방산 조성 측면에서도 스트레스 강도의 최적 범위가 존재함을 시사하며, 특히 C18:1의 비율이 증가한 45 및 65 mg L-1 조건의 P.W.W.는 바이오디젤 원료로서 상대적으로 높은 활용 가치를 가질 가능성을 보여준다.

    3.4.2. FAME 조성에 기반한 바이오디젤 품질 지표 분석

    FAME 조성에 기반한 바이오디젤 품질 지표 분석 결과, 모든 처리군에서 세탄가(cetane number, CN)는 EN 14214 기준 (≥51)을 충족하여 연소 특성 측면에서 바이오디젤 원료로서의 기본적인 활용 가능성을 확인하였다(Table 3).

    특히 BG11-ammonia nitrogen 조건에서는 포화지방산 (SFA) 비율 증가로 인해 CN이 가장 높게 나타났으나, 지질 축적량은 오히려 감소하여 고암모니아 무기배지 조건이 저장지질 축적에는 불리함을 시사하였다 (Table 3). 이는 연료 품질 지표와 지질 생산성이 반드시 정비례하지 않음을 보여준다. 반면 P.W.W. 45 및 65 mg L-1 조건에서는 단일불 포화지방산(MUFA) 비율 증가에 따라 요오드값(iodine value, IV)과 불포화도 지수(degree of unsaturation, DU) 가 뚜렷하게 증가하였으며, 이는 동일한 질소 농도에서도 폐수 매질 특성이 지방산 조성을 저장지질 축적에 유리한 방향으로 조절할 수 있음을 의미한다.

    또한 본 연구에서 분석된 모든 처리군에서 C18:2 및 C18:3과 같은 다중불포화지방산이 검출되지 않아, 산화 안정성(oxidation stability) 저하에 대한 우려는 제한적인 것으로 판단된다. 이는 장기 저장 및 유통 과정에서의 연료 안정성 확보 측면에서 중요한 장점으로 작용할 수 있다. 다만, 포화지방산 비율이 높은 조성은 저온 유동성(cold flow property) 측면에서 불리하게 작용할 가능성이 있어, 실제 연료 적용 시에는 블렌딩 또는 공정적 보완이 필요할 수 있다.

    돈폐수 조건에서 관찰된 MUFA 비율 증가는 폐수 매질 특성에 따른 Chlamydomonas sp.의 대사적 적응을 반영하는 결과로 해석될 수 있다. 폐수 내 유기탄소 존재로 혼합 영양 성장이 가능해지면서 glycolysis 및 TCA cycle을 통한 acetyl-CoA 공급이 증가하고, 이에 따라 지방산 생합성이 촉진되었을 가능성이 있다(Lee et al. 2021a). 동시에 혼합영양 조건에서 확보된 환원력(NADPH)은 포화지방산을 단일불포화지방산으로 전환하는 desaturase 반응을 촉진하여 MUFA 축적에 기여했을 것으로 판단된다(Chen and Jiang 2017; Zhang et al. 2018). 이러한 결과는 본 연구 조건에서 고도 불포화 지질 합성보다는, 산화 안정성과 세포 안정성을 동시에 만족하는 저장지질 축적이 우선적으로 유도되었음을 시사한다.

    4. 결 론

    본 연구에서는 모델 미세조류인 Chlamydomonas sp.를 이용하여 돈폐수(P.W.W.) 환경에서의 대사 반응, 영양염 제거 특성, 그리고 지방산 조성 변화를 평가하였다. 그 결과, 돈폐수 조건은 BG11-ammonia nitrogen 조건에 비해 암모니아, 총인(TP), 총유기탄소(TOC)의 제거에서 높은 효율을 보였으며, 이는 미세조류가 폐수 내 복합 이온 조성과 스트레스 요인에 어떻게 반응하는지를 확인할 수 있는 실험적 기반을 제공하였다.

    또한 지질 및 지방산 분석 결과, 돈폐수 환경은 Chlamydomonas sp.의 지질 축적을 유도하고, C16:0 및 C18:1 등 특정 지방산의 비율 변화를 동반함을 확인하였다. 이러한 지방산 조성의 변화는 폐수 환경이 미세조류의 지방산 합성 경로 및 탄소 분배 전략에 영향을 미칠 수 있음을 시사하며, 미세조류 대사 조절 연구를 위한 중요한 기초 정보를 제공한다.

    본 연구는 폐수 처리를 위한 생물공정보단 모델 미세조류를 활용하여 폐수와 미세조류 간 상호작용을 대사적·생리적으로 이해하기 위한 기반 연구라는 점에서 의의가 크다. Chlamydomonas sp.는 유전체·전사체 정보가 잘 구축된 모델 생물이므로, 향후, 전사체 분석 및 대사 네트워크 해석을 통해 본 연구에서 관찰된 영양염 제거 및 지방산 변화의 분자적 기작을 규명할 수 있을 것으로 기대된다.

    적 요

    미세조류를 이용한 폐수 처리는 영양염 제거와 바이오자원 회수를 통합할 수 있는 지속가능한 전략으로 점차 주목 받고 있다. 본 연구에서는 모델 미세조류 Chlamydomonas sp.를 이용하여 돈폐수(piggery wastewater, P.W.W.) 환경에서의 영양염 제거 성능과 지질 축적 및 지방산 조성 변화를 분석하였다. 암모니아 농도를 45, 65, 85 mg L-1로 조정한 돈폐수 환경에서 배양한 결과, Chlamydomonas sp.는 BG11-ammonia nitrogen 대조구에 비해 암모니아, 총인(TP), 총유기탄소(TOC)의 제거효율이 현저히 높게 나타났다. 지질 함량은 65 mg L-1 조건에서 38.6%, 85 mg L-1에서 최대 44%까지 증가하여, 높은 암모니아 스트레스가 지질 축적 유도가 확인하였다. 지방산 메틸에스터(FAME) 분석 결과, 폐수 조건에서 C18:1 (올레산)의 비율이 증가하여 바이오디젤 생산에 유리한 조성이 형성되었으나, 과도한 암모니아 농도에서는 바이오디젤 관련 지방산 축적이 저해되는 경향을 보였다. 본 연구는 고농도 암모니아 폐수 환경에서 Chlamydomonas sp.의 대사적 적응 및 지질 대사 조절 메커니즘을 규명함으로써, 미세조류 기반 폐수 처리와 바이오 매스 자원화 기술 개발을 위한 기초적 통찰을 제공한다

    사 사

    본 과제는 2025년도 교육부 및 제주도의 재원으로 제주 RISE센터의 지원을 받아 수행된 지역혁신중심 대학지원 체계(RISE) (2025-RISE-17-001) 및 과학기술정보통신부의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행되었습니다(RS-2024-00358292).

    CRediT authorship contribution statement

    EB Joa: Conceptualization, Methodology, Data curation, Writing-Original draft. SA Lee: Conceptualization, Supervision, Writing-Review & editing, Funding acquisition.

    Declaration of Competing Interest

    The authors declare no conflicts of interest.

    Figure

    KJEB-44-1-1_F1.jpg

    Survival response of microalgae under ammonia toxicity after 24 h at initial biomass concentrations of (a) 0.2 g L-1, (b) 0.4 g L-1, (c) 0.6 g L-1, and (d) 0.8 g L-1. (e) shows the boxplot of OD680 values with statistical differences among groups determined by one-way ANOVA (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001). TAN stands for total ammonia nitrogen.

    KJEB-44-1-1_F2.jpg

    Time profiles of (a) dry cell weight (D.C.W.), (b) total ammonia concentration (TAN), (c) total phosphorus (TP), and (d) total organic carbon (TOC) measured every 12 h over 48 h at an initial biomass concentration of 0.63 g L-1. The BG11-ammonia nitrogen control was supplemented with 65 mg L-1 NH3 -N. P. W.W. stands for piggery wastewater.

    KJEB-44-1-1_F3.jpg

    Total lipid content (%) is calculated from the dry weight of extracted lipids following solvent -based lipid extraction. BG11- ammonia N stands for BG11-ammonia nitrogen and P. W.W. stands for piggery wastewater.

    KJEB-44-1-1_F4.jpg

    Fatty acid composition (%) of Chlamydomonas sp. under varying ammonia concentrations, expressed as the relative proportion of each fatty acid to the total fatty acid methyl esters (FAMEs) following transesterification. BG11-ammonia N stands for BG11-ammonia nitrogen and P. W.W. stands for piggery wastewater.

    Table

    Inhibitory concentration (IC) values (IC10, IC50, and IC90) of ammonia toxicity to Chlamydomonas sp. at different initial biomass concentrations (mg L-1 as NH3 -N)

    Percentage changes in dry cell weight (D.C.W.), total ammonia nitrogen (TAN), total phosphorus (TP), and total organic carbon (TOC) between 0 and 48 h (relative to the initial values at 0 h; values rounded to one decimal place)

    aBG11-ammonia nitrogen; bPiggery wastewater

    Biodiesel quality indices calculated from fatty acid methyl ester (FAME) composition at 48 h under different culture conditions (indices were calculated based on identified FAMEs only; the “Other” fraction was excluded, and the composition was normalized to 100%). Values were rounded to one decimal place.

    *NA: not applicable; Oxidation stability was not calculated because C18:2 and C18:3 were not detected in the profiles.
    Abbreviations: BG11-ammonia N, BG11-ammonia nitrogen; P. W.W., piggery wastewater; CN, cetane number; SV, saponification value (mg KOH g-1); IV, iodine value (g I2 100 g-1); DU, degree of unsaturation; SFAs, saturated fatty acids; MUFAs, monounsaturated fatty acids; PUFAs, polyunsaturated fatty acids; C18:3, linolenic acid.

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    Vol. 40 No. 4 (2022.12)

    Journal Abbreviation 'Korean J. Environ. Biol.'
    Frequency quarterly
    Doi Prefix 10.11626/KJEB.
    Year of Launching 1983
    Publisher Korean Society of Environmental Biology
    Indexed/Tracked/Covered By

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