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ISSN : 1226-9999(Print)
ISSN : 2287-7851(Online)
Korean J. Environ. Biol. Vol.44 No.2 pp.103-114
DOI : https://doi.org/10.11626/KJEB.2026.44.2.103

Developmental toxicity and metabolomic profiling of the fungicide trifloxystrobin in zebrafish embryos

Chaeeun Kim, Sangman Lee, Sung-Eun Lee*
Department of Applied Biosciences, Kyungpook National University, Daegu 41566, Republic of Korea
*Corresponding author Sung-Eun Lee Tel. 053-950-7768 selpest@knu.ac.kr

Contribution to Environmental Biology


▪ Trifloxystrobin exposure induced developmental toxicity in zebrafish embryos, including edema formation, reduced body length, and developmental delay.


▪ GC-TOF-MS-based metabolomics revealed that trifloxystrobin disrupted fatty acid, amino acid, and energy metabolism pathways in developing zebrafish embryos.


1 June 2026 15 June 2026 24 June 2026

Abstract


Trifloxystrobin (TFS) is a strobilurin fungicide commonly used in agriculture that inhibits mitochondrial respiratory chain complex III in fungi. Given its widespread use, it is crucial to evaluate its toxic effects on aquatic organisms. This study investigated the developmental toxicity and metabolomic changes in zebrafish (Danio rerio) embryos exposed to TFS for up to 96 hours post-fertilization (hpf). TFS exposure significantly reduced the survival and hatching rates of zebrafish embryos in a concentration-dependent manner, with a 96 h LC50 value of 264.9 μg L-1. Morphological analysis revealed several developmental abnormalities, including yolk sac edema, pericardial edema, reduced body length, and severe developmental delay. Metabolomic analysis using GC-TOF-MS demonstrated a clear distinction between control and TFS-treated groups in PLS-DA score plots, indicating significant alterations in metabolic profiles due to TFS exposure. A total of 42 differential metabolites were identified, encompassing organic acids, amino acids, carbohydrates, and fatty acid-related metabolites. Specifically, glutaric acid, glyceric acid, citric acid, and several fatty acid derivatives increased in the TFS-treated group, while oxalic acid, fumaric acid, malic acid, glucose, and fructose decreased. Pathway enrichment analysis highlighted significant disruptions in fatty acid biosynthesis, the TCA cycle, amino acid metabolism, and carbohydrate metabolism pathways. These findings indicate that TFS exposure interferes with multiple metabolic pathways critical for energy metabolism and developmental processes in zebrafish embryos, thereby suggesting potential ecological risks associated with TFS contamination in aquatic environments.


strobilurin fungicide , trifloxystrobin , zebrafish , early-life stage , aquatic ecotoxicology

살균제 trifloxystrobin 노출에 따른 제브라피쉬 배아의 발달 독성 및 대사체 프로파일 분석

김채은, 이상만, 이성은*
경북대학교 응용생명과학과

초록

    1. 서 론

    Trifloxystrobin (TFS)은 strobilurin 계열의 살균제로, QoI (quinone outside inhibitor) 살균제로도 알려져 있다 (Sauter et al. 1999). 이 계열의 살균제는 전자전달계 내 cytochrome b (cyt b)의 quinol oxidation (Qo) 부분에 결합하여 cyt b와 cyt c1 사이의 전자전달을 저해하고, 결과적으로 미토콘드리아 막에서의 ATP 생성을 억제한다 (Yamaguchi and Fujimura 2005;Rodrigues et al. 2013). TFS는 국내외에서 식물병 방제를 위해 널리 사용되고 있으며, 사용량 또한 지속적으로 증가하고 있다 (Han et al. 2012;Macar et al. 2022;Xiao et al. 2023). 이로 인해 TFS는 수계 환경에서 빈번하게 검출되고 있으며 중국 양쯔강에서는 최대 0.02 ng L-1, 미국 Nebraska’s Rainwater Basin Wetlands에서는 최대 0.33 μg L-1의 농도로 검출된 바 있다 (Mimbs et al. 2016;Wang et al. 2023). 특히, 수계 환경에 잔류할 경우 어류를 포함한 수생생물에 부정적인 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다 (Morrison et al. 2013;Li et al. 2022).

    TFS는 여러 diastereomer로 존재하며, 그중 E,E-TFS가 수계 환경에서 어류에 대한 발달독성이 가장 강한 것으로 알려져 있다 (Kim et al. 2023). 예를 들어, 제브라피쉬 (Danio rerio) 배아에 대한 E,E-TFS의 LC50 (Lethal concentration 50%) 값은 0.68 mg L-1로 보고되었으며, 다른 diastereomer (Z,Z-TFS, Z,E-TFS, E,Z-TFS)의 LC50 값은 모두 2.0 mg L-1 이상이었다. 또한 EC50 (effective concentration 50%) 값 역시 E,E-TFS에서만 0.24 mg L-1로 확인되어, 다른 이성질체보다 높은 독성을 나타냈다 (Kim et al. 2023).

    최근에 다양한 오믹스 (omics) 기법을 활용하여 환경오염물질 및 천연물질의 독성 기작을 규명하려는 연구가 활발하게 진행되고 있다 (Yu et al. 2022;Duan et al. 2023;Lim et al. 2025). 이러한 접근은 기존에 알려진 주요 작용기작뿐만 아니라 아직 규명되지 않은 잠재적 독성 작용점들도 확인할 수 있는 기회를 제공한다. TFS에 노출 후 수행한 오믹스 연구로, 성체 제브라피쉬를 0.1, 1.0, 10 μg L-1 농도의 TFS에 21일간 노출시킨 후 조직학적, 전사체, 대사체 분석을 통해 독성 영향과 생물학적 반응을 조사한 사례가 있다 (Chen et al. 2024). 해당 연구에서는 TFS에 노출이 제브라피쉬 성체의 간, 난소 및 심장의 발달에 영향을 미쳤으며, 대사체 분석 결과 glycogen, lactose, lactulose, maltose, maltotriose 및 D-trehalose와 같은 포도당 기반 탄수화물 함량이 감소한 것으로 나타났다. 이는 탄수화물의 대사 및 ABC transporter 관련 경로의 저하와 연관된 것으로 보고되었다 (Chen et al. 2024). 이러한 결과는 TFS가 전자전달계 QoI의 저해제로 작용할뿐만 아니라, 기관 형성 과정과 정상적인 생리 기능을 교란하고 해당과정 및 ABC transporter의 발현과 기능에도 부정적인 영향을 미칠 수 있음을 확인하였다.

    그러나, 현재까지 TFS에 노출된 제브라피쉬 배아를 대상으로 한 오믹스 연구는 보고된 바 없으며, 이러한 연구는 TFS에 의한 배아 발달독성을 기작을 이해하는데 중요한 정보를 제공할 것으로 예상된다. 따라서 본 연구에서는 제브라피쉬 배아를 활용하여 TFS의 발달독성과 이에 따른 대사체 변화를 평가하였다. 대사체 분석에 앞서 TFS에 의한 급성독성 및 발달독성을 평가하고, 수정 후 72시간 및 96시간에서의 LC50 값, 부화율 및 표현형의 변화를 측정하였다. 이후 GC-TOF-MS 기반 대사체 분석을 수행하여 TFS 노출이 제브라피쉬 배아에 미치는 분자적 영향을 제시하였다.

    2. 재료 및 방법

    2.1. 시험 물질

    TFS는 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)사의 analytical standard grade 시약을 구매하였다. Stock solution을 제조하기 위해 HPLC-grade acetonitrile (ACN, Duksan Pure Chemicals, Ansan, Korea)을 사용하였으며, 3,200 mg L-1 농도로 제조하였다. 이후 50, 100, 200, 400 및 800 mg L-1 농도로 각각 조제하여 노출실험에 사용하였다.

    2.2. 제브라피쉬 사육 조건 및 배아 수집

    본 연구에서는 야생형 제브라피쉬 (D. rerio)를 사용하였으며, 연구실 내에서 5세대 이상 유지 및 사육한 개체를 사용하였다. 제브라피쉬는 수온이 27±1°C로 유지된 수조에서 암컷과 수컷 개체를 분리하여 사육하였다. 명암 주기는 14 h: 10 h으로 유지하였으며, 먹이는 Artemia sp. (DTI Brine Shrimp Eggs, DTI, UT, USA)를 하루 2회 공급하였다. 제브라피쉬 배아를 수집하기 위해 노출 실험 하루 전 산란용 수조에 암컷과 수컷을 각각 1마리씩 넣었으며, 총 5쌍을 사용하였다. 다음날 광 자극을 통해 산란된 배아를 수집하였으며, 수집된 배아는 27±1°C로 설정된 배양기에 보관하였다.

    2.3. TFS의 제브라피쉬 배아에 대한 급성 독성 평가

    TFS 처리에 따른 제브라피쉬 배아의 급성 독성을 평가하기 위해서 OECD 테스트 가이드라인 236번을 기반으로 시험을 수행하였다 (OECD 2025). 수집한 배아는 수정 후 3시간에 배아 발달 단계의 형태학적 지표를 기준으로 정상 개체만 선별하였다. 선별된 배아는 6-well plate의 각 well 당 15마리씩 분주하고 각 well당 5 mL의 E3 배지를 첨가하였으며, 실험에 사용된 총 배아 수는 270마리였다. E3 배지는 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 및 0.33 mM MgSO4를 포함하도록 제조하였으며, pH는 7.0으로 맞추었다. 수정 후 6시간 (shield stage)에 제조한 stock solution을 처리하여 최종 농도가 50, 100, 200, 400 및 800 μg L-1가 되도록 하였다. 대조구에는 동일한 양의 ACN을 처리하였으며, 모든 처리구의 최종 ACN 농도는 0.1%로 맞추었다. 물질 처리는 1회 수행하였으며, 배아는 수정 후 96시간까지 동일한 용액에서 노출하였다. 시험 기간 동안 24시간 간격으로 치사율, 부화율 및 기형 발생 여부를 확인하였다. 노출 종료시점에 각 처리 농도군의 대표적인 배아의 표현형 (정상, 난황부종, 심낭부종 등)을 촬영하였으며, 각 표현형의 발생 비율은 실체현미경을 이용하여 모든 배아를 관찰한 후 산출하였다. 또한, 각 처리군에서 무작위로 선별한 배아 10마리를 대상으로 Image J software (NIH, USA)를 이용하여 전장길이를 측정하였다.

    2.4. 대사체 분석을 위한 제브라피쉬 배아 시료 준비

    급성독성 평가 결과를 기반으로 독성이 관찰된 농도인 TFS 200 μg L-1를 대사체 분석 농도로 선정하였다. 대사체 분석을 위해 충분한 양의 시료를 확보하기 위해 유리 페트리디쉬를 이용하여 실험을 수행하였다. TFS 노출에 따른 치사 개체 발생 가능성을 고려하여 각 처리군에서 배아 150마리씩 6반복 (총 900마리)을 준비하였으며, 각 디쉬에는 배아 150마리와 E3 배지 20 mL를 넣었다. 수정 후 6시간에 대조군에는 최종 농도가 0.1%가 되도록 ACN을 처리하였고, 처리군에는 TFS가 최종 농도 200 μg L-1 (ACN 0.1%)가 되도록 처리하였다. 수정 후 72시간에 부화한 배아의 chorion을 제거하고, 수정 후 96시간에 각 처리군의 생존 개체 중에서 배아 200마리를 무작위로 선별하여 하나의 시료로 구성하였다. 이러한 과정을 통해 처리군당 3개의 biological replicate를 준비하였으며, 각 replicate는 배아 200마리로 구성되었다. 이후 처리 용액을 제거한 뒤 HPLC grade 물을 이용하여 2회 세척하였으며, 잔여액은 완전히 제거하였다. 세척이 완료된 시료는 -80°C에서 급속 냉동하여 보관하였다. 시료는 동결건조기 (PVTFD20R; ilShinBioBase, Yangju, Korea)를 이용하여 72시간 동안 동결건조 후 시료는 대사체 추출 전까지 -80°C에 보관하였다.

    2.5. 대사체 추출

    동결건조된 제브라피쉬 배아 시료에 내부표준물질인 2-chloro-phenylalanine이 포함된 HPLC-grade methanol 1 mL를 첨가하였다. 이후 MM400 Mixer Mill (Retsch, Haan, Germany)을 이용하여 30 Hz 조건에서 10분간 초음파 추출을 수행하였다. 추출된 시료는 4°C에서 21,000×g 조건으로 10분간 원심분리 후, 상등액은 0.22 μm PTFE syringe filter를 이용하여 여과했다. 대사체 추출물은 speed vacuum concentrator (Biotron, Seoul, Korea)를 이용하여 완전히 건조하였다. Oximation 유도체화를 위해 건조된 시료에 pyridine에 용해한 methoxyamine hydrochloride 용액 (20 mg mL-1) 50 μL를 첨가한 후, 30°C에서 90분간 반응시켰다. 이후 silylation 유도체화를 위해 N-trimethylsilyl-N-methyl trifluoroacetamide 50 μL를 첨가하고, 37°C에서 30분간 반응시켰다. 최종 반응액은 여과한 뒤 2 mL vial에 옮겨 GC-TOF-MS 분석에 사용하였다.

    2.6. GC-TOF-MS를 이용한 대사체 분석

    유도체화된 시료는 Agilent 7890A GC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)와 Pegasus HT TOF-MS (Leco Corporation, St. Joseph, MI, USA)가 연결된 GC-TOF-MS 시스템을 이용하여 분석하였다. 운반기체로는 He을 사용하였으며, 유속은 1.5 mL min-1으로 일정하게 유지하였다. 대사체 분리를 위해 Rtx-5MS capillary column (30 m×0.25 mm×0.25 μm film thickness; Restek, Bellefonte, PA, USA)을 사용하고, 시료 주입량은 1 μL였으며, split ratio는 15: 1로 설정하였다. 질량분석은 50~600 m/z 범위에서 수행하였다. 각 시료는 3회 반복 분석하였으며, 분석의 재현성과 신뢰성을 확보하기 위해 각 시료 추출물의 동일 부피를 혼합하여 제조한 quality control 시료를 포함하였다.

    2.7. 데이터 처리 및 통계 분석

    GC-TOF-MS 분석을 통해 획득한 raw data는 NetCDF (*.cdf) 형식으로 변환한 후, MetAlign software (http://www.metalign.nl)를 이용하여 머무름 시간 (retention time, min) 및 질량 대 전하 비 (mass-to-charge ratio, m/z)를 기준으로 정렬하였다. 시료 간 대사체 프로파일 비교를 위해 SIMCA-P+ software (version 15.0.2; Umetrics AB, Umea, Sweden)를 이용하여 principal component analysis (PCA) 및 partial least squares discriminant analysis (PLS-DA)를 수행하였다. 차등 대사체는 p-value<0.05 및 variable importance in projection (VIP) score>0.7 기준을 이용하여 선별하였다. 확인된 차등 대사체에 대한 enrichment analysis는 MetaboAnalyst 6.0 (http://www.metaboanalyst.ca/)을 이용하여 수행하였다. 모든 결과는 mean±standard deviation으로 나타내었고, 통계분석은 SPSS software (version 30.0; IBM Corp., Armonk, NY, USA)를 이용하여 수행하였다. 통계적 유의성은 일원배치 분산분석 후 Duncan’s 사후검정을 통해 결정하였다. 그래프 작성은 GraphPad Prism software (version 8.0.2; GraphPad Software, San Diego, CA, USA)를 이용하였고, 치사농도 값은 SAS software (version 9.4; SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용한 probit 분석을 통해 산출하였다. 대사체 데이터의 시각화를 위한 heatmap 분석은 R software (version 4.6.0; R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria)를 이용하여 수행하였다.

    3. 결 과

    3.1. 제브라피쉬 배아에서 TFS 노출에 따른 생존율 및 부화율

    수정 후 6시간에 TFS를 제브라피쉬 배아에 노출시켜 수정 후 96시간까지 생존율과 부화율을 평가하였다 (Fig. 1). 수정 후 72시간에서의 생존율은 400 μg L-1 처리구까지 유의한 영향을 보이지 않았으나, 800 μg L-1 처리구에서는 생존율이 64.5%로 감소하였다 (Fig. 1a). 수정 후 96시간에 100 μg L-1 처리구까지는 생존율의 유의한 변화가 나타나지 않았으나, 200 μg L-1 및 400 μg L-1 처리구에서는 각각 80% 및 49%의 생존율을 보였다 (Fig. 1b). 또한, 최고 농도인 800 μg L-1 처리구에서는 수정 후 96시간의 모든 개체가 치사하였다 (Fig. 1b). 부화율을 분석한 결과, 수정 후 72시간에는 400 μg L-1 이상의 처리구에서 모든 배아가 부화하지 못하였다 (Fig. 1c). 수정 후 96시간에도 400 μg L-1 이상의 처리구에서 모든 배아가 부화하지 못하고, 200 μg L-1 처리구의 부화율도 67%로 통계적으로 유의하게 감소하였다 (Fig. 1d).

    3.2. 제브라피쉬 배아에서 TFS의 치사농도

    TFS에 대한 제브라피쉬 배아의 치사농도 값을 산출한 결과, 노출 시간이 증가함에 따라 독성이 증가하는 경향이 나타났다 (Table 1). 수정 후 72시간에서의 LC10, LC50 및 LC90 값은 각각 247.9, 718.3 및 2,082 μg L-1로 나타났으며, 수정 후 96시간에서는 각각 116.8, 264.9 및 600.5 μg L-1로 낮아진 농도에도 치사 값이 나타남을 확인하였다. 특히 96시간 노출 시 LC50 값이 72시간 대비 약 2.7배 낮게 나타나, TFS의 독성이 노출 시간에 따라 증가하는 것으로 확인되었다.

    3.3. TFS 노출에 따른 표현형 및 전장 길이 변화

    TFS 노출에 따른 제브라피쉬 배아의 발달 영향을 정상, 난황부종 (yolk sac edema), 심장부종 (pericardial edema)과 같은 표현형 관찰을 통해 평가하였다 (Fig. 2). 수정 후 96시간에서 배아의 표현형을 관찰한 결과, 100 μg L-1 처리구까지는 일부 개체에서 난황부종이 관찰되었으나 대조군과 비교해서 뚜렷한 차이는 나타나지 않았다 (Fig. 2a, b). 반면, 200 μg L-1 처리구에서는 50% 이상의 개체가 심낭부종과 난황부종을 함께 가진 형태를 보였다. 또한 400 μg L-1 처리구에서는 심각한 발달 지연이 확인되었으며, 배아가 수정 후 약 16~17시간 단계에 해당하는 17-somite stage에서 발달이 정지된 상태가 나타났다. 배아의 전장 길이를 측정하여 TFS에 의한 발달 영향을 평가하였다 (Fig. 2c). 대조군과 비교하였을 때, 50 μg L-1 및 200 μg L-1 처리구의 전장 길이는 각각 2.8%와 10.1% 감소하였으며, 이러한 감소는 통계적으로 유의하였다. 또한 400 μg L-1 처리구에서는 정상적인 발달이 진행되지 못함에 따라 체장이 거의 성장하지 못한 것으로 확인되었다.

    3.4. TFS 노출에 따른 제브라피쉬 배아의 대사체 변화

    대조군과 TFS 200 μg L-1 처리구에 대한 GC-TOF-MS 기반 대사체 분석 결과에 대해 다변량 통계분석을 수행하였다. PCA score plot에서 대조군 (CON)과 TFS 처리 그룹은 일부 겹치는 양상을 보였으나, 그룹 간 분리가 관찰되었다 (Fig. 3a). 그룹 간 대사체 차이를 보다 명확하게 확인하기 위해 PLS-DA 분석을 수행하였으며, 이를 기반으로 유의한 차이를 나타내는 대사체를 선별 및 동정하였다 (Fig. 3b). 두 그룹 간 유의한 차이를 나타내는 대사체 42종을 선별 및 동정하였으며, 해당 대사체 정보는 Table 2에 제시하였다. 또한 대사체의 상대적 함량 변화를 heatmap으로 시각화한 결과, 대조군과 TFS 처리 그룹 간 대사체 패턴의 차이가 뚜렷하게 나타났다 (Fig. 4). 유기산 대사체의 경우, TFS 처리 그룹에서 glutaric acid, glyceric acid 및 citric acid의 상대 함량이 대조군에 비해 증가한 반면, oxalic acid, fumaric acid 및 malic acid의 상대 함량은 감소하였다. 아미노산 대사체에서는 proline, threonine 및 tyrosine의 상대 함량이 증가하였으나, serine과 aspartic acid의 상대 함량은 감소하는 경향을 보였다. 또한 TFS 처리 그룹에서는 지방산 및 지방산 유도체들의 상대 함량이 전반적으로 증가하였다. Carbohydrate-related metabolites의 경우 glycerol의 상대 함량은 증가한 반면, fructose와 glucose의 상대 함량은 감소하였다. 이와 함께 pyrimidine 및 uridine과 같은 nucleotide-related metabolites의 상대 함량 역시 TFS 처리 그룹에서 증가하는 경향이 나타났다.

    3.5. TFS 노출에 따른 대사경로 변화 분석

    TFS 처리에 의해 변화된 대사체를 기반으로 metabolic pathway enrichment analysis를 수행하였다 (Fig. 5). 분석 결과, fatty acid biosynthesis pathway가 가장 유의하게 변화한 대사경로로 확인되었고, arginine biosynthesis, glyoxylate and dicarboxylate metabolism, citrate cycle (TCA cycle) 및 galactose metabolism과 같은 에너지 및 탄수화물 대사 관련 경로들도 유의한 변화가 나타났다. 또한 glycine, serine and threonine metabolism, alanine, aspartate and glutamate metabolism과 같은 아미노산 대사 경로 역시 영향을 받는 것으로 확인되었다. 이와 함께 biosynthesis of unsaturated fatty acids 및 glycerolipid metabolism 경로의 변화가 관찰되어, TFS 노출이 지질 대사에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 전반적으로 TFS는 제브라피쉬 배아에서 에너지 대사, 아미노산 대사 및 지질 대사와 관련된 다양한 대사경로에 영향을 유도하는 것으로 확인되었다.

    4. 고 찰

    4.1. 제브라피쉬 배아에 대한 TFS의 급성독성

    수정 후 6시간에 TFS를 노출한 결과 96-h LC50 값은 264.9 μg L-1로 확인되어 강한 급성독성이 나타났다 (Table 1). 또한, 노출 시간이 증가함에 따라 생존율은 급격히 감소하였으며, 96-h LC50 값은 72-h LC50 값보다 약 2.7배 높은 독성이 나타났다. 이러한 결과는 E,E-TFS의 제브라피쉬 배아에 대한 LC50 값과 비교하였을 때 약 2.5배 차이를 보였으며 (Kim et al. 2023), 이는 배아의 상태나 노출 처리 시 조건 등의 차이에서 원인을 찾을 수 있다. 실제로 다른 연구에서는 TFS의 제브라피쉬 배아에 대한 LC50 값이 55 μg L-1로 보고된 바 있으며, 이는 본 연구 결과 및 Kim et al. (2023) 값보다 각각 약 4.8배 및 12배의 차이가 나타난다 (Li et al. 2018). 한편, TFS의 급성독성을 다른 strobilurin 계열 살균제와 비교하였을 때, pyraclostrobin의 경우 LC50 값은 61 μg L-1이었으며, picoxystrobin의 경우 LC50 값은 86 μg L-1로 보고되었다 (Li et al. 2018). 그러나 본 연구에서 확인된 TFS의 LC50 값은 pyraclostrobin 및 picoxystrobin보다 높게 나타났으며, 이를 고려하였을 때 TFS가 다른 strobilurin 계열 살균제보다 더 강한 급성독성을 나타낸다고 단정하기는 어려울 것으로 판단된다.

    부화율의 경우 TFS는 400 μg L-1 처리 농도에서부터 100% 부화 억제 효과가 나타났으며, 이러한 영향은 노출 시간이 증가함에 따라 더욱 심화되었다 (Fig. 1). 이전 연구에서도 TFS는 250 μg L-1 이상의 농도에서 제브라피쉬 배아의 부화율을 유의적으로 감소시키는 것으로 보고된 바 있다 (Kim et al. 2023). 본 연구에서도 TFS 노출에 따른 전장길이 감소가 200 μg L-1 이상의 농도에서 확인되었는데 (Fig. 2), 이는 이전 연구에서 250 μg L-1 농도에서 전장길이의 감소가 관찰된 것과 유사하다 (Kim et al. 2023). 상대적으로 고농도인 400 μg L-1 처리군에서는 전장길이가 현저히 감소한 것으로 나타났는데, 이는 배아의 발달이 정상적으로 진행되지 못한 상태로 chorion 내부에 머물러 있기 때문이다. 흥미롭게도 다른 diastereomer인 Z,Z-TFS, Z,E-TFS, E,Z-TFS의 경우, 각각 1 mg L-1, 2 mg L-1, 2 mg L-1 농도에서 제브라피쉬 배아의 전장길이 감소가 보고된 바 있다 (Kim et al. 2023).

    다른 표현형의 변화로서 난황부종 및 심낭부종이 TFS 200 μg L-1 처리 농도부터 동시에 관찰되었으며 (Fig. 2), 이는 TFS가 심장 기관 발달에 부정적인 영향을 미칠 가능성을 시사한다. 이러한 가능성은 이전 연구 결과에서도 뒷받침된다. E,E-TFS의 경우 250 μg L-1 처리 농도에서 제브라피쉬 배아의 심장 발달이 현저하게 저해되었으며, 정상적인 cardiac looping 형성이 관찰되지 않았다 (Kim et al. 2023). 또한, 심장 발달 독성을 나타낸 E,E-TFS 노출 배아에서는 심장 기능이 급격히 저하되어 심장 박동수가 정상 그룹 대비 50% 이하 수준으로 감소하였다 (Kim et al. 2023). 또한, 다른 strobilurin 계열 살균제인 pyraclostrobin 역시 50 μg L-1 이상의 농도에서 제브라피쉬 배아에 심낭부종을 유발하였으며, 심장 발달에 대한 독성이 강하게 나타났다 (Kim et al. 2021). 이러한 결과는 strobilurin 계열 살균제가 공통적으로 제브라피쉬 배아의 심장 발달 과정과 기능 유지에 영향을 미칠 가능성을 시사한다.

    4.2. TFS 노출에 따른 제브라피쉬 배아의 대사체 변화

    Strobilurin 계열 살균제의 작용점은 미토콘드리아 내막에 존재하는 cytochrome bc1 복합체의 QoI 부위로 알려져 있으며, QoI 부위에 결합하여 cyt b와 cyt c1 사이의 전자전달을 방해하여 ATP 생성을 억제하는 독성기작을 가지고 있다 (Rodrigues et al. 2013). 따라서 TFS 역시 제브라피쉬 배아의 전자전달계 기능을 교란하여 미토콘드리아 내 ATP 생성을 억제할 것으로 추측된다. 본 연구의 대사체 결과, TFS에 노출된 제브라피쉬 배아에서는 glyoxylate and dicarboxylate metabolism 및 citrate cycle (TCA cycle) 경로에서 유의한 변화가 확인되었다 (Fig. 5). 이러한 결과는 TFS의 전자전달계 저해 기작과 직접적인 관계가 있는 것으로 판단된다. Glyoxylate 회로는 acetyl-CoA와 같은 두 개의 탄소를 가진 물질을 이용하여 glucose를 합성할 수 있도록하며, dicarboxylate 물질의 분해 대사를 통하여 세포의 에너지 생성에 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다 (Huang et al. 2025). 특히, TFS 처리군에서는 aspartic acid와 malic acid의 상대 함량이 대조군 대비 감소한 것으로 나타났는데 (Fig. 4), 이는 malate-aspartate shuttle (MAS)의 기능 저하와 관련될 가능성이 있다. MAS는 해당 과정에서 생성된 NADH와 같은 환원당량 (reducing equivalents)을 미토콘드리아 내부로 전달하는 중요한 기작으로 알려져 있다 (Cooper and Jeitner 2016). 따라서 TFS는 미토콘드리아 막을 통한 환원당량의 이동을 방해함으로써 세포 내 에너지 대사과정에 영향을 미쳤을 가능성이 있다. 유사하게, 환경오염물질에 의한 MAS의 기능저하는 임신 기간 중 대기오염 물질인 PM2.5에 노출된 산모의 산후 대사체에서도 보고된 바 있다 (Aldana et al. 2025).

    흥미로운 결과로서, 본 연구에서 TFS에 노출된 제브라피쉬 배아는 glycerol의 상대 함량이 증가한 반면, fructose와 glucose의 상대 함량은 감소한 것으로 나타났다 (Fig. 4). 이러한 결과는 TFS에 노출된 제브라피쉬 성체에서 glycogen, lactose, lactulose, maltose, maltotriose, D-trehalose와 같은 탄수화물관련 대사체 함량이 감소한 결과와 유사한 경향을 보였다 (Chen et al. 2024). 일반적으로 glucose는 hepatocyte에서 glycogen 분해 과정을 통해 생성되므로, Chen et al. (2024) 연구에서 확인된 glycogen 함량 감소는 glucose 생성 저하와 밀접하게 연관되었을 가능성이 있다. 따라서 본 연구에서 관찰된 fructose 및 glucose 함량 감소 역시 TFS에 의한 탄수화물 대사 교란과 에너지 생성 저해를 반영하는 결과로 판단된다.

    또한 TFS 처리군의 제브라피쉬 배아에서는 지방산 및 지방산 유도체의 상대 함량이 대조군에 비하여 전반적으로 증가하였다 (Fig. 4). 이와 유사하게, 또 다른 strobilurin 계열 살균제인 pyraclostrobin을 제브라피쉬 성체에 21일간 노출시킨 연구에서는 glycerophospholipid의 축적과 glucose 함량의 감소가 보고된 바 있다 (Jiang et al. 2025). 이러한 결과는 strobilurin 계열 살균제가 공통적으로 지질대사 및 에너지 대사 경로에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 다만, 지질 관련 대사체의 변화 양상은 발달 단계에 따라 차이를 보일 수 있다. 배아 단계의 제브라피쉬는 난황에 저장된 지질을 주요 에너지원으로 활용하며, 기관 형성 및 세포 증식이 활발하게 진행되는 시기이다 (Quinlivan and Farber 2017). 따라서 TFS 노출에 따른 에너지 대사 교란은 배아에서 지방산의 동원 또는 축적을 유도하였을 가능성이 있다.

    이와 함께 pyrimidine 및 uridine과 같은 nucleotide-related metabolites의 상대 함량 역시 TFS 처리군에서 증가하는 경향이 나타났다 (Fig. 4). 전반적으로 TFS는 제브라피쉬 배아에서 에너지 대사, 아미노산 대사 및 지질 대사와 관련된 다양한 대사경로에 영향을 유도하는 것으로 확인되었다 (Fig. 5). 이러한 결과는 또 다른 strobilurin 계열 살균제인 E-kresoxim methyl에 노출된 제브라피쉬 배아에서 보고된 glycine, serine, threonine metabolism과 같은 아미노산 대사와 citrate cycle 및 pentose phosphate pathway와 같은 에너지 대사 관련 경로의 변화와 유사한 경향이다 (Son et al. 2025). 따라서 본 연구 결과는 strobilurin 계열 살균제가 공통적으로 제브라피쉬 배아의 에너지 생성 및 대사 항상성 유지에 영향을 미칠 가능성을 시사한다. 비록 현재까지 보고된 TFS의 환경 중 검출 농도는 본 연구에서 독성이 관찰된 농도보다 낮은 수준이지만 (Mimbs et al. 2016;Wang et al. 2023), 농업 환경에서의 광범위한 사용과 지속적인 환경 유입을 고려할 때 수생생물은 장기간 반복적으로 노출될 가능성이 있다. 따라서 향후에는 환경 중 검출 농도를 반영한 만성 노출 연구와 함께 전사체, 대사체 등 다중 오믹스 분석을 활용하여 strobilurin 계열 살균제의 독성 기전을 보다 종합적으로 규명할 필요가 있을 것으로 판단된다.

    5. 결 론

    Strobilurin계 살균제는 수계환경 중 어류독성이 강한 물질로 노출될 경우 급성 및 발달독성이 나타나므로 이들에 대한 환경 중 특히 수계 잔류 농도를 꾸준히 모니터링해야 한다. 특히, 사용량이 많은 기간은 이들의 수계 유입을 인지하고 이들의 독성효과를 저감할 수 있는 방법 등을 적용하여 그 피해를 줄이는 관리 방법도 제시해야 한다. 나아가 수계에는 다양한 독성 물질들이 공존하고 있으므로 strobilurin계 살균제를 포함한 측정환경농도에서의 복합독성을 연구하여 이들 오염물질에 대한 이해도를 높여야한다.

    적 요

    Trifloxystrobin (TFS)은 농업 분야에서 널리 사용되는 strobilurin 계열 살균제로, 곰팡이의 미토콘드리아 복합체 III를 저해하는 것으로 알려져 있다. TFS는 농업환경에서 광범위하게 사용되고 있기 때문에 수생생물에 대한 독성 영향 평가가 필요하다. 본 연구에서는 TFS에 의한 발달독성 및 대사체 변화를 평가하기 위해 제브라피쉬 (Danio rerio) 배아를 수정 후 96시간까지 TFS에 노출하였다. TFS 노출은 농도 의존적으로 생존율 및 부화율을 감소시켰으며, 96시간 LC50 값은 264.9 μg L-1로 나타났다. 형태학적 분석 결과, 난황부종, 심낭부종, 체장 감소 및 심각한 발달 지연과 같은 이상이 관찰되었다. TFS 노출에 대한 차등 대사체는 총 42종이 선별되었으며, 유기산, 아미노산, 탄수화물 및 지방산 관련 대사체가 포함되었다. TFS 처리군에서는 glutaric acid, glyceric acid, citric acid 및 일부 지방산 유도체의 상대 함량이 증가한 반면, oxalic acid, fumaric acid, malic acid, glucose 및 fructose의 상대 함량은 감소하였다. 대사경로 분석 결과, fatty acid biosynthesis, TCA cycle, amino acid metabolism 및 carbohydrate metabolism과 관련된 경로에서 유의한 변화가 확인되었다. 이러한 결과는 TFS 노출이 제브라피쉬 배아에서 에너지 대사 및 발달 과정과 관련된 다양한 대사경로를 교란시킴을 보여주며, 수생환경 내 TFS 오염이 생태학적 위해성을 유발할 가능성이 있음을 시사한다.

    사 사

    이 성과는 정부 (과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임 (2022R1A2C1092970).

    CRediT authorship contribution statement

    C Kim: Investigation, Methodology. Writing-Original draft. S Lee: Resources, Software. SE Lee: Supervision, Writing-Review & editing, Project administration.

    Declaration of Competing Interest

    The authors declare no conflicts of interest.

    Figure

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    Effects of trifloxystrobin (TFS) exposure on acute toxicity in zebrafish embryos up to 96 h post-fertilization (hpf). Survival rates of embryos at 72 hpf (a) and 96 hpf (b). Hatching rates of embryos at 72 hpf (c) and 96 hpf (d). Data are presented as mean±SD (n=15, triplicates). Statistical significance was determined using one-way ANOVA followed by Duncan’s post hoc test.

    KJEB-44-2-103_F2.jpg

    Developmental toxicity of trifloxystrobin (TFS) in zebrafish embryos at 96 h post-fertilization (hpf). (a) Representative images of embryos exposed to TFS at concentrations ranging from 0 to 400 μg L-1. (b) Percentages of phenotypic abnormalities observed in larvae at each treatment concentrations. (c) Body length of embryos measured at 96 hpf (n=10). Statistical significance was determined using one-way ANOVA followed by Duncan’s post hoc test. YE, yolk sac edema; PE, pericardial edema. Scale bar means 200 μm.

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    Multivariate analysis of metabolomic profiles in zebrafish embryos exposed to trifloxystrobin (TFS, 200 μg L-1) at 96 h post-fertilization (hpf). (a) Principal component analysis (PCA) score plot showing the distribution of control (CON) and TFS-treated groups. (b) Partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA) score plot demonstrating the separation between CON and TFS-treated groups based on metabolomic profiles. Each point represents an individual replicate.

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    Heatmap analysis of differential metabolites in zebrafish embryos exposed to trifloxystrobin (TFS, 200 μg L-1) at 96 h post-fertilization (hpf). Relative levels of metabolites identified in control (CON) and TFS-treated groups are presented using hierarchical clustering analysis. Red and blue colors indicate relatively increased and decreased metabolite levels, respectively. N.I., not identified.

    KJEB-44-2-103_F5.jpg

    Metabolic pathway enrichment analysis of differential metabolites identified in zebrafish embryos exposed to trifloxystrobin (TFS, 200 μg L-1). Significantly altered metabolic pathways between control (CON) and TFS-treated groups were identified based on metabolomic profiling. The color gradient and circle size indicate pathway significance and pathway impact, respectively.

    Table

    Lethal concentration (LC) values (μg L-1) of trifloxystrobin in zebrafish embryo at 72 and 96 h post-fertilization (hpf)

    aLC values were calculated using Probit analysis. Values in parentheses indicate 95% confidence intervals.

    Differential metabolites identified in zebrafish embryos exposed to trifloxystrobin (TFS, 200 μg L-1) at 96 h post-fertilization

    aRT, retention time
    bVIP, variable importance in projection
    cSTD, standard; MS, mass spectrum

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    Vol. 40 No. 4 (2022.12)

    Journal Abbreviation 'Korean J. Environ. Biol.'
    Frequency quarterly
    Doi Prefix 10.11626/KJEB.
    Year of Launching 1983
    Publisher Korean Society of Environmental Biology
    Indexed/Tracked/Covered By

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